[发明专利]一种从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法

权利要求书

1.一种从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法，以如下比例量、条件和步骤实施：

(1)取新鲜婴儿粪便样品10g，加入100mL预冷的无菌水，在冰浴环境下间歇搅拌20min，使样品中的蛋白质充分溶解在无菌水中，得到混悬液；

(2)将混悬液加入50mL离心管中，6000±500rpm离心5±2min，小心收集上清液；离心管中剩余的膏状物再次9000±500rpm离心5±2min，小心收集上清液；离心管中剩余的膏状物再次12000±500rpm离心5±2min，小心收集上清液；将三次收集的上清液混合，得到总上清液；

(3)向步骤(2)中的总上清液中加入硫酸铵，去除液体表面的漂浮物，收集剩余液体；

(4)向步骤(3)中收集的剩余液体中加入氯仿，去除油脂，收集沉淀物；

(5)向步骤(4)的沉淀物中加入50mL、100mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液，在冰浴环境中至沉淀完全溶解，然后用孔径为30kDa的透析袋过夜透析，产物命名为粗酶液I，透析液为100mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲液；

(6)粗酶液I经过冷冻干燥后，加入2mL、100mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液即制得粗酶液II；

(7)粗酶液II经过阴离子交换色谱和凝胶过滤层析纯化，即获得初步纯化的乳糖酶；

其特征在于，

步骤(3)所述向步骤(2)中的总上清液中加入硫酸铵，去除液体表面的漂浮物，收集剩余液体的方法是：向步骤(2)中的总上清液中加入质量浓度为80±10％的硫酸铵，待充分溶解后冰浴10±2小时，然后12000±1000rpm离心20±5分钟，去除液体表面的漂浮物，收集剩余液体；

步骤(4)所述向步骤(3)中收集的剩余液体中加入氯仿，去除油脂，收集沉淀物的方法是：向步骤(3)中收集的剩余液体中加入氯仿，二者体积量比为1:1±0.1，利用氯仿提取与蛋白质络合的油脂，待加入的氯仿充分涡旋混匀后，以12000±1000rpm离心20±5分钟，收集沉淀物；

步骤(7)所述阴离子交换色谱采用GE公司型号为HiTrap Q HP的色谱柱；所述凝胶过滤层析采用GE公司型号为Sephadex G200的凝胶过滤层析柱。

2.根据权利要求1所述从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法，其特征在于：步骤(3)所述向步骤(2)中的总上清液中加入硫酸铵，去除液体表面的漂浮物，收集剩余液体的方法是：向步骤(2)中的总上清液中加入质量浓度为80％的硫酸铵，待充分溶解后冰浴10小时，然后12000rpm离心20分钟，去除液体表面的漂浮物，收集剩余液体。

3.根据权利要求1所述的从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法，其特征在于：步骤(4)所述向步骤(3)中收集的剩余液体中加入氯仿，去除油脂，收集沉淀物的方法是：向步骤(3)中收集的剩余液体中加入氯仿，二者体积量比为1:1，利用氯仿提取与蛋白质络合的油脂，待加入的氯仿充分涡旋混匀后，以12000rpm离心20分钟，收集沉淀物。