[发明专利]一种从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法

说明书

本发明公开了一种从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法，步骤是溶解粪便样品、收集可溶性蛋白质；加入硫酸铵，冰浴，离心，去除漂浮物，收集液体；再加入氯仿抽提与蛋白质络合的油脂，利用高速离心收集沉淀；再加入磷酸盐缓冲液溶解沉淀并透析获得产物命名为粗酶液I；粗酶液I经过冷冻干燥、磷酸盐缓冲液溶解后得粗酶液II；粗酶液II经过阴离子交换色谱和凝胶过滤层析纯化，即获得初步纯化的乳糖酶。本发明方法易操作、目标产物得率高，有利于后续新型乳糖酶的质谱鉴定，酶产物可应用于食品生产领域。

技术领域

本发明涉及一种从复杂组分中分离酶蛋白的方法，尤其涉及一种从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法，属于生物技术领域。

背景技术

乳糖酶(Lactase)即β-D-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23,β-D-galactosidase)，可以水解乳糖产生葡萄糖和半乳糖被人或动物利用。当缺少乳糖酶或其酶活性差时，机体内的乳糖不能被水解和吸收，直接进入小肠下段和结肠，在肠道菌群的作用下产生短链脂肪酸、氢气、甲烷和二氧化碳，出现腹胀、腹痛和腹泻等临床症状，称为乳糖不耐症。在新生儿和婴儿时期，母乳或配方奶粉是婴儿的主要食物，其中含有大量乳糖；在这一时期，由于乳糖酶缺少所引起的腹泻最为常见，对婴儿的生长非常不利，因此临床上推荐食用乳糖酶制剂，用以缓解该症状。此外，乳糖酶还具有合成活性，可将半乳糖转变为低聚半乳糖，有助于婴儿建立健康的肠道菌群，还能够促进婴儿体内钙的吸收。

乳糖酶多来源于微生物，包括细菌、霉菌和放线菌等，其中细菌占绝大多数，如乳杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、大肠杆菌(Escherichia)、嗜热链球菌(Streptococcus)和产气肠杆菌(Enterobacter)等均可产生乳糖酶。传统获得乳糖酶的方法是筛选产生乳糖酶的微生物，利用生物化学的方法从微生物的培养物中分离纯化乳糖酶，通常涉及到使用氯化钠、硫酸铵盐析或乙醇、氯仿有机物浓缩培养物及离子交换色谱、凝胶过滤层析方法。但是，这样的方法只针对可培养微生物，对不可培养微生物则无法触及，因此会导致酶的多样性信息严重丢失。例如，在健康婴儿体内，其肠道微生物也可以合成乳糖酶，但是肠道微生物多数不可培养，如果单从微生物分离角度入手可能错过潜在的乳糖酶。鉴于乳糖酶在肠道产生后会伴随着肠道蠕动和排便进入婴儿的粪便中，因此从粪便中直接分离乳糖酶是获得新型乳糖酶的一种有效方法。婴儿粪便与微生物培养物不同，其组成复杂，其中主要含有蛋白质、脂肪、无机盐离子和消化液残余等，用传统的分离纯化方法很难获得目标蛋白质。经检索，有关如何从婴儿粪便中分离乳糖酶的专利或可用方法还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出一种快速、简易从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法。

本发明所述从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法，以如下比例量、条件和步骤实施：

(1)取新鲜婴儿粪便样品10g，加入100mL预冷的无菌水，在冰浴环境下间歇搅拌20min，使样品中的蛋白质充分溶解在无菌水中，得到混悬液；

(2)将混悬液加入50mL离心管中，6000±500rpm/min离心5±2min，小心收集上清液；离心管中剩余的膏状物再次9000±500rpm/min离心5±2min，小心收集上清液；离心管中剩余的膏状物再次12000±500rpm/min离心5±2min，小心收集上清液；将三次收集的上清液混合，得到总上清液；

(3)向步骤(2)中的总上清液中加入硫酸铵，去除液体表面的漂浮物，收集剩余液体；

(4)向步骤(3)中收集的剩余液体中加入氯仿，去除油脂，收集沉淀物；

(5)向步骤(4)的沉淀物中加入50mL、100mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液，在冰浴环境中至沉淀完全溶解，然后用孔径为30kDa的透析袋过夜透析，产物命名为粗酶液I，透析液为100mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲液；