[发明专利]基于碱基编辑靶向CD133的CAR-T细胞制备方法及应用

权利要求书

1.一种PD-1基因被敲除的CAR-T细胞，其特征在于，PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，采用的基因敲除方法是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。

2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的基因敲除通过BE-Plus系统来实现，具体为：选定基因敲除的位点，设计靶点序列sgRNA，随后筛选出靶点序列，具体如下所示：

sgRNA1-F：如SEQ ID NO.3所示；

sgRNA1-R：如SEQ ID NO.4所示；

sgRNA2-F：如SEQ ID NO.5所示；

sgRNA2-R：如SEQ ID NO.6所示；

sgRNA3-F：如SEQ ID NO.7所示；

sgRNA3-R：如SEQ ID NO.8所示；

所示靶点序列可用于质粒载体上，慢病毒载体上，或用于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其他类型载体上。

3.如权利要求2所示的CAR-T细胞，其特征在于，所述选出的靶点序列为如下序列：

sgRNA1-F：如SEQ ID NO.3所示；

sgRNA1-R：如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求1-3任一项所述的CD133-CAR包含CD133-scFv，CD133-scFv用于识别CD133抗原，该CD133-scFv序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求4所述的PD-1基因被敲除的表达CD133-CAR的T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）从供者提供的外周血中分离PBMC；

（2）在转染体系中，将表达CD133-CAR质粒、转座酶质粒、BE Plus双质粒、靶向PD-1的sgRNA质粒共同转染步骤（1）PBMC细胞，获得转染后的细胞，并进行体外培养、大量扩增；

（3）用CD3抗体刺激步骤（2）得到的细胞，以获得PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，并对所获得T细胞进行后续检测。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，表达CD133-CAR的质粒为PiggyBac-transposon载体依次串联启动子、信号肽、CD133-scFv序列、铰链区、跨膜区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的，其中CD133-ScFv序列为优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1（LFA-1）、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244,2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述启动子为人EF1α启动子，所述胞内信号传导区为CD28-4-1BB-CD3ζ，铰链区为CD8 Hinge嵌合受体铰链，跨膜区为CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其步骤（2）中所述转染的方法为电转转染方法，将构建好的多个质粒通过电转的方式转染入分选的细胞中。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述靶向PD-1的sgRNA质粒是通过将靶点序列退火获得的互补寡核苷酸双链片段导入pGL3-U6-sgRNA质粒所得。

11.如权利要求1-3任一项所述的PD-1基因被敲除的CAR-T细胞的用途，其特征在于，用于制备抗肿瘤的细胞治疗药物，特别是靶向CD133阳性的肿瘤干细胞的细胞治疗药物。