[发明专利]基于碱基编辑靶向CD133的CAR-T细胞制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于碱基编辑制备PD‑1基因敲除且靶向CD133的CAR‑T细胞制备方法及应用。通过BE‑Plus系统进行基因敲除的同时将表达白细胞分化抗原CD133‑CAR的质粒载体导入T细胞的制备方法，所得CAR‑T细胞可应用于制备抗肿瘤药物。本发明公开的PD‑1基因敲除且靶向CD133的CAR‑T细胞制备工艺简单，在肿瘤的细胞治疗中拥有较高的应用价值。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种敲除PD-1基因且表达CD133-CAR的T细胞的制备方法及其应用。

背景技术

CD133是一种细胞表面抗原标志，属prominin家族成员之一，也被称为prominin-1，在人类中是由PROM1基因编码的糖蛋白。其属于跨膜蛋白的一员，特异定位于细胞突起。当嵌入细胞膜时，在细胞膜中prominin-1的膜拓扑结构使N端延伸到胞外空间，C端位于胞内腔室。CD133在造血干细胞、内皮祖细胞、胶质母细胞瘤、神经元和胶质干细胞、各种小儿脑肿瘤、以及成人肾、乳腺、气管、唾液腺、子宫、胎盘、消化道、睾丸等细胞类型中表达。其分子结构较为独特，同时表达呈组织依赖性。有文献报道，CD133阳性细胞和肿瘤发生、转移、侵袭、耐药及复发均关系密切。

CD133最初被描述为人类造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的表面抗原，是最常用的肿瘤干细胞(CSC)分离的标记物，主要来自各种胶质瘤和癌细胞。另外CD133作为混合系白血病MLL-AF4的关键靶点，并在发生MLL重排的B-ALL中均有表达。在CD133和消化系肿瘤的相关报道中，国内对胃癌组织采用RT-PCR技术测得CD133在癌旁和原发组织间的差异具有统计学意义，提示CD133和胃癌产生密切相关。

CAR-T是一种通过把患者自己的防御细胞（T细胞）取出来，人工（依靠基因技术）加上一种能够识别癌症细胞的部件（癌细胞识别抗原受体），并大量复制，再给回患者，从而激发患者自身防御细胞的杀伤功能杀死癌症细胞。嵌合抗原受体（CAR）是CAR-T的核心部件，使得免疫细胞HLA具有非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力。CAR分子的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区（Single chain antibody Fragment，ScFv），一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号转导区。其中scFv段的设计对于CAR的特异性、有效性以及基因改造免疫细胞自身的安全性是关键的决定因素。

将患者T细胞制作成CAR-T细胞，然后经过体外扩增后，回输到患者体内进行抗肿瘤治疗，与传统肿瘤治疗方法相比，该方法为细胞靶向性治疗，副作用小，而且经过基因修饰的T细胞可在其表面稳定的表达抗原结合域，识别靶抗原的同时，无MHC限制性，提高了肿瘤的治疗效果。已有报道表明CD133特异性的CAR-T细胞或NK细胞，可杀死来源于病患的神经胶质瘤干细胞或卵巢癌干细胞。在一个晚期胆管癌患者中，CD133特异性CAR-T细胞治疗获得了持续4.5个月的部分响应。

在实体瘤的免疫治疗方面，CAR-T细胞的活性易受多种因素影响，比如缺乏肿瘤特异性抗原，或者难以到达肿瘤部位，以及易受肿瘤微环境影响丧失功能或活性。肿瘤微环境的免疫逃逸机制主要是通过PD-1/PD-L1抑制通路，导致T细胞不能杀伤肿瘤细胞。通过靶向敲除PD-1基因，可以解除PD-1/PD-L1的抑制通路，有助于改良靶向CD133的CAR-T细胞的功效。此外，将CAR-T细胞进行PD-1基因敲除，使其免受肿瘤微环境的抑制，可能提高靶向杀伤能力。

中国专利201710793243.9已公开了一种PD-1基因沉默的靶向CD133的CAR T细胞及制备方法，其是通过将CRISPR-Cas9和PiggyBac转座子系统同时导入PBMC中敲除靶向CD133的CAR T细胞中的PD-1基因而获得，其结果显示PD-1基因敲除且靶向CD133的CAR-T细胞对U251 CD133-OE靶细胞在不同效靶比条件下杀伤效率均高于未敲除组。但是，CRISPR-Cas9介导的基因编辑存在严重的脱靶效应，使其在临床应用上存在一定的安全隐患。