[发明专利]一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法

权利要求书

1.一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法，其特征在于该方法的步骤包括：

(1)获得浮萍愈伤组织：获得浮萍愈伤组织：无菌环境下，切除在液体培养基上培养的浮萍的假根，后横切浮萍的叶状体，利用愈伤诱导培养基对其进行愈伤组织的诱导，再利用再培培养基对浮萍愈伤进行愈伤继代，昼夜周期为16/8小时/天，光强66μmolm^-2s^-1，21℃下培养愈伤组织21天；

(2)浮萍愈伤组织的转化：

1)用穿刺法从甘油冻存管中沾取菌液，利用农杆菌固体培养基平板活化携带有凡那滨对虾抗菌肽pen3表达载体的农杆菌2次；

2)利用10ml农杆菌液体培养基对农杆菌进行小体积扩繁；

3)取步骤2)扩繁好的农杆菌菌液1ml移至40ml加有相应抗生素抗性(kana 50μg/ml+str 50μg/ml+rif20μg/ml)的农杆菌液体培养基中，28℃培养箱对其进行振荡培养7～11h，测定菌液在600纳米下的OD值，OD₆₀₀为0.42～0.82之间时停止培养；

4)对步骤3)获得的菌液进行常温离心，5000g 6min，收集沉淀下来的菌体

5)利用转化培养液溶解菌体(共培养液成分为B5液体培养基+1％蔗糖+0.2％Tween20)；

6)用消毒后的镊子在超净台无菌条件下夹取浮萍愈伤组织，将其转移至转化培养菌液内，室温下抽真空3次，每次1分钟；

7)28℃缓慢振荡共培养30min；

8)将共培养液体吸出，将外植体置于滤纸上待菌液彻底被吸干后，将愈伤组织移至固体共培养培养基上；

9)固体共培养1～3d，长出菌圈后，用无菌水(含300mg/L头孢霉素)清洗愈伤组织3～5次，滤纸吸干后，移至筛选培养基(继代培养基+30mg/L潮霉素+300mg/L头孢霉素)上；

10)筛选20d后，将愈伤组织移至再生培养基(含潮霉素0.5mg/L，头孢霉素300mg/L)上；

11)20天浮萍再生成功后，将浮萍移至DATKO液体培养基(含潮霉素1mg/L)中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第1)步所述的浮萍愈伤诱导培养基的组成包括：2500mg/l KNO3、250mg/l MgSO₄·7H₂O、121mg/l CaCl₂·2H₂O、134mg/l(NH₄)₂SO₄、169.6mg/l NaH₂PO₄·2H₂O、0.025mg/l、27.8mg/l FeSO₄·7H₂O、2.0mg/l ZnSO₄·7H₂O、0.025mg/l CoCl₂·6H₂O、0.25mg/l Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/l CuSO₄·5H₂O、0.75mg/l KI、3.0mg/l H₃BO₄、10mg/l MnSO₄·4H₂O、27.8mg/l FeSO₄·7H₂O、1.5％蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l维生素B6、10mg/l维生素B1、1.5％麦草畏、2.5％2,4-D、1.5％6-BA、0.6％琼脂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第(1)步所述的浮萍愈伤再培培养基的组成包括：2500mg/l KNO₃、250mg/l MgSO₄·7H₂O、121mg/l CaCl₂·2H₂O、134mg/l(NH₄)₂SO₄、169.6mg/l NaH₂PO₄·2H₂O、0.75mg/l KI、3.0mg/l H₃BO₄、10mg/l MnSO₄·4H₂O、27.8mg/lFeSO₄·7H₂O、2.0mg/l ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/l Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/l CoCl₂·6H₂O、0.025mg/l CuSO₄·5H₂O、1.5％蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l烟酸、1.0mg/l维生素B6、10mg/l维生素B1、10mg/L PCA、2mg/L 2iP、0.6％琼脂。