[发明专利]一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法

说明书

本发明公开了一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法，本发明以浮萍为材料，利用浮萍转化体系对浮萍进行转基因，筛选得到转化凡纳滨对虾抗菌肽基因pen3的浮萍。经分子生物学鉴定，浮萍基因组DNA具有pen3基因。培养浮萍后的液体培养基和浮萍提取液均具有抑菌能力。本项发明的成套浮萍表达抗菌肽系统不仅完成了基因转化，而且液体培养基也具有抗菌能力，液体培养基添加到水塘后，是虾蟹培养过程中非常重要和实用的抑菌途径，还具备避免鱼虾等水生生物抗生素使用量过高的问题，是鱼虾免疫应用研究中不可缺少的关键操作。

本发明得到国家重点研发计划资助(2018YFD0901301)，国家自然科学基金青年项目(31700443)，天津市水产产业技术体系创新团队(ITTFRS2017007)的资助。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法。

背景技术

浮萍是单子叶水面漂浮植物，隶属于浮萍科浮萍属，广布于世界各地，其个体小，扩繁快，蛋白含量高，通过光照可控制其无性繁殖等显著优点使其成为理想的高通量外源蛋白表达和基因研究体系。抗菌肽具有广谱抗菌性，并对部分病毒、寄生虫和癌细胞等均具有抗性，同时可提高免疫力和伤口愈合，是取代常规抗生素、解决致病菌抗药性问题的极佳选择。因此，将抗菌肽替代抗生素应用于生产实践越来越受到科学工作者和水产养殖业的重视。

对虾素(Penaeidin，Pen)是特异性存在于对虾体内的一类抗菌肽,能抑制细菌生长繁殖或直接杀灭细菌,主要对革兰氏阳性菌与真菌有抑菌活性，还可以作为一种调理因子在先天免疫中间接发挥作用。对虾素由富含脯氨酸的N末端和一个富含半胱氨酸的C端组成，根据氨基酸序列和特定氨基酸被分为五个亚类，Pen-1，-2，-3，-4，-5，Penaeidins 编码基因已在多种虾中被克隆和鉴定。

同对虾种类体内，各种对虾素的表达水平不同，在凡纳滨对虾体内，Pen2、Pen3、Pen4的转录水平较高，其中以Pen3为最高，并且，Pen3是各种对虾体内普遍存在的高表达基因。pen-3与pen-5已被报道参与了对抗对虾白斑综合征病毒(white spot syndromevirus，WSSU)的过程，可利用价值非常高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法，按照下列步骤进行：

(一)获得浮萍愈伤组织：无菌环境下，切除在液体培养基上培养的浮萍的假根，后横切浮萍的叶状体，利用愈伤诱导培养基对其进行愈伤组织的诱导，再利用再培培养基对浮萍愈伤进行愈伤继代，昼夜周期为16/8小时/天，光强66μmolm^-2s^-1， 21℃下培养愈伤组织21天；

(二)浮萍愈伤组织的转化：

(1)从甘油冻存管中用穿刺法沾取菌液，利用农杆菌固体培养基平板活化携带有凡那滨对虾抗菌肽pen3表达载体的农杆菌2次；

(2)利用10ml农杆菌液体培养基小体积扩繁农杆菌；

(3)取步骤(2)扩繁好的农杆菌菌液1ml移至40ml加有相应抗生素抗性(kana 50 μg/ml+str 50μg/ml+rif20μg/ml)的农杆菌液体培养基中，28℃培养箱对其进行振荡培养7～11h，测定菌液在600纳米下的OD值，OD₆₀₀为0.42～0.82之间时停止培养；

(4)对步骤(3)获得的菌液进行常温离心，5000g 6min，收集沉淀下来的菌体