[发明专利]一种扩增H5N6亚型禽流感病毒全基因组的通用引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种扩增H5N6亚型禽流感病毒全基因组的通用引物组、试剂盒及方法，设计的引物组进行一步法RT‑PCR扩增，12对引物所有体系一致、退火温度一致，扩增条件一致，此方法省去了一个引物一个最适退火温度的操作，使操作方法更加简便，省时、省力。同一反应程序可以同时扩增多种基因片段，可快速获得H5N6亚型禽流感病毒的基因组全长序列，扩增H5N6亚型禽流感病毒全基因组时间较短，1.5天可获得全基因组。具有简便，耗时少，节约成本等优点。

技术领域

本发明涉及病毒基因组扩增，具体涉及一种扩增H5N6亚型禽流感病毒全基因组的通用引物、试剂盒及方法。

背景技术

禽流感是禽流行性感冒的简称，是由A型流感病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)传染病。禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)感染后可以表现为轻度的呼吸道症状、消化道症状。根据禽流感病毒致病性和毒力的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。禽流感病毒是有包膜的RNA病毒，形态不规整，外观形态为直径80～120nm的球状或长达数千纳米的丝状，其基因组由8条单股负链RNA组成，共编码10种蛋白质，包括血凝素(Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)、核蛋白(Nucleoprotein，NP)、基质蛋白(Stroma protein，SP)、聚合酶蛋白(PB1，PB2，PA)、非结构蛋白(Nonstructural proteins，NS)和其他蛋白质(HE，M2，M3，NB)。

近些年来，高致病性禽流感病毒在田间不断变异，2013～2014年，课题组在河南、河北、广东、广西、江苏、福建、山东、云南等地区进行禽流感病毒流行病学调查时，分离到了HA 基因序列位于2.3.4的新进化分支，即类2.3.4分支，该分支已成为华南等地区的主要流行毒株，2014～2015年度H5亚型禽流感流行病学调查结果表明，类“clade 2.3.4”基因型的毒株数量增加最快、污染面最广，H5N1、H5N2、H5N6和H5N8等多种亚型毒株共存，给养禽业造成较大的损失，“clade 2.3.4”基因型的毒株并没有减弱之势，给养禽业造成巨大损失。2016～ 2018年H5亚型禽流感流行病学调查结果表明，clade 2.3.4分支成主要流行分支，截止目前，现有H5N6亚型禽流感病毒均属于该分支，因此研究能快速获得H5N6亚型禽流感病毒的全基因组序列对于禽流感流行病学的调查分析及禽流感防控至关重要。

现有H5N6亚型禽流感病毒的全基因组测序存在以下缺点：传统的实验室进行基因克隆测序，是将DNA片段连接到载体中，再转化至感受态细菌，然后筛选出阳性克隆菌进行扩繁，扩繁后提取细菌质粒DNA，再送往专业测序公司进行测序。此方法耗时、成本高、效率低，不适合大批量的测序，这种方法难以发现混合病毒感染，容易得出错误的全基因组序列。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种扩增H5N6亚型禽流感病毒全基因组的通用引物组。

本发明的另一目的在于提供一种扩增H5N6亚型禽流感病毒全基因组的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种扩增H5N6亚型禽流感病毒全基因组的方法

本发明的又一目的在于提供一种H5N6亚型禽流感病毒全基因组的测序方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种扩增H5N6亚型禽流感病毒全基因组的通用引物组，其核苷酸序列如下所示：

引物对1：

HA1-F：AGCARAAGCAGGG(SEQ ID NO:1)

HA1-R：TCTGCTCAATAGGTGTT(SEQ ID NO:2)

引物对2：

HA2-F：CCAAAATRAACGGGCA(SEQ ID NO:3)