[发明专利]Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的检测方法

说明书

本发明公开了Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的检测方法，涉及生物技术领域。该方法包括：提取RNA；将RNA逆转录得到cDNA；以cDNA为模板进行套式PCR，套式PCR完成后，对产物进行检测分析。该方法通过对人源和鼠源细胞以及动物组织进行检测，分别检测到了Exon1的剪接，有效证明了Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的存在，Exon1的剪接，有效证明了Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的存在，对HD细胞模型中检测不到内源性敲入PolyQ转录体的现象给出了合理的解释，同时，为HD的致病机理的研究及其治疗提供进一步的理论基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的检测方法。

背景技术

亨廷顿病(Huntington’s Disease，HD)是一种罕见的家族性常染色体显性遗传性的神经退行性疾病。典型临床表现：不自主舞蹈样动作，进行性认知功能障碍等。目前HD的致病原因被公认为是亨廷顿基因（Htt）上的三核苷酸CAG重复序列异常加长，导致编码的HTT蛋白构象变化，突变蛋白在神经细胞中积累，造成神经细胞功能紊乱，并引发神经细胞死亡。

为了进一步研究HD的治病机理，并以此获得HD的治疗方法，HD细胞模型和动物模型被广泛使用。目前，成功构的建HD疾病模型有很多。在细胞模型方面，基于iPSCs和ESCs的HD细胞模型研究较多，但其并不能完整反映HD的发病过程、及其发病过程中分化（功能）神经元细胞的内环境变化情况。基于此，申请人利用CRISPR技术，构建了一种基于分化的神经元细胞的HD细胞模型（已申请专利，申请号 201810513348.9），该可以清晰地跟踪离体细胞HD发展的过程及其胞内环境的变化，提供了一种优良的用于改善和治疗HD疾病的药物或治疗方式的筛选平台。

申请人对该DNA原位敲入的HD细胞模型进行继续研究，在检测其RNA转录时并没有找到内源性敲入PolyQ转录体。随后申请人进行了多种尝试，如改变培养条件，添加谷氨酸、谷氨酰胺等，都没能够检测到内源性敲入PolyQ转录体。在后来的研究过程中，申请人偶然发现Htt基因转录RNA Exon1或许可能存在内剪接现象，该现象或许影响了内源性敲入HD细胞模型Htt基因转录RNA的完整性（在RNA转录或成熟阶段选择性的剪接丢弃了有致病性的加长PolyQ片段）。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的检测方法，通过该方法检测到了Exon1的内剪接，有效证明了Htt基因转录RNAExon1内剪接现象的存在，为HD的致病机理的研究及其治疗提供进一步的理论基础。

本发明采用的技术方案如下：

Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的检测方法，其包括如下步骤：

（1）提取RNA；

（2）将RNA逆转录得到cDNA；

（3）以cDNA为模板进行套式PCR，套式PCR包括先后进行的第一次PCR和第二次PCR，第一次PCR的上下游引物分别为F-F和F-R，第二次PCR的上下游引物分别为T-F和T-R；套式PCR完成后，对产物进行检测分析。

本发明的一种Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的检测方法，步骤（2）中，RNA进行逆转录前，除去其中的基因组DNA。

本发明的一种Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的检测方法，F-F碱基序列如SEQID NO.1所示；F-R碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的一种Htt基因转录RNA Exon1内剪接现象的检测方法，F-F碱基序列如SEQID NO.1所示；F-R碱基序列如SEQ ID NO.3所示。