[发明专利]一种关节软骨冷冻保护液及软骨冷冻保存方法

说明书

本发明提供一种关节软骨冷冻保护液，所述冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：羧甲基淀粉18‑22份、鼠李糖2‑3份、鲸蜡烯1‑2份、微晶纤维素2‑4份、半乳甘露糖4‑6份、胞壁酰二肽4‑6份、三棕榈酰五肽3‑5份、α‑熊果苷0.5‑1.5份、去离子水70份。本发明还提供一种采用关节软骨冷冻保护液进行软骨冷冻保存方法，包括淋洗、滴加部分冷冻保护液、加入剩余冷冻保护液、程序降温。本发明不使用二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；本发明所述关节软骨冷冻保存方法，冷冻保存第8周取出复温后，关节软骨的细胞成活率为82‑85%，第10周关节软骨的细胞成活率为78‑80%。

技术领域

本发明涉及一种关节软骨冷冻保护液及软骨冷冻保存方法，属于生物材料技术领域。

背景技术

随着年龄增长，关节软骨容易受到损伤、磨损，软骨移植是目前治疗软骨损伤的重要的方法之一，经低温冷冻保存的同种异体软移植治疗关节软缺损已经获得了很好的治疗效果，但是生物材料脱离供体后实现长时间的保存很难，随着低温保存技术的不断发展，研究表明在深低温环境中的离体生物材料会逐渐减缓其新陈代谢，甚至停止新陈代谢。

CN104938478A公开了一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法，采用的冷冻保护液，每1000ml包含：99.9％二甲基亚砜150～250ml、乙酰胺110～200g、1,2-丙二醇70～120ml、聚乙二醇10～80g、海藻糖20 ～100g，余为去离子水。使软骨细胞存活率在冷冻保存第8周时仍保持在一个较高水平(由传统组的60％提高到68％)。

CN108835105A公开了一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法，所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜200-300份、角鲨烯25-60份、分心木多糖20-35份、四氢澳洲茄胺12-25份、虾青素2-7份、水10-30份；其制备的冷冻保护液，在第8周将关节软骨复温后，关节软骨的细胞存活率依然可达76％，在第10周将关节软骨复温后，关节软骨的细胞存活率依然可达71％。

上述专利虽然在低温保存关节软骨中取得一定的进展，但仍然存在以下不足：

（1）关节软骨的细胞存活率仍然较低，保存时间短；

（2）均采用二甲基亚砜作为主要冷冻保护成分，但DMSO具有细胞毒性和渗透损伤，解冻后需要充分冲洗去除DMSO，但是已进入细胞内的DMSO难以彻底清洗掉。

发明内容

为解决现有技术存在的不足，本发明提供一种关节软骨冷冻保护液及软骨冷冻保存方法，实现以下发明目的：

（1）不使用二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；

（2）提高复苏后细胞成活率，延长冷冻保存时间。

为实现上述发明目的，采用以下技术方案：

一种关节软骨冷冻保护液，所述冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：羧甲基淀粉18-22份、鼠李糖2-3份、鲸蜡烯1-2份、微晶纤维素2-4份、半乳甘露糖4-6份、胞壁酰二肽4-6份、三棕榈酰五肽3-5份、α-熊果苷0.5-1.5份、去离子水70份。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：羧甲基淀粉20份、鼠李糖3份、鲸蜡烯2份、微晶纤维素3份、半乳甘露糖5份、胞壁酰二肽5份、三棕榈酰五肽4份、α-熊果苷1份、去离子水70份。

所述冷冻保护液的制备方法为：将各组分混合搅拌均匀后，先在3MPa下进行均质处理3分钟，然后采用超声处理，超声频率为18HZ，时间为10分钟，温度为40℃，超声处理后，调节pH至7，得到稳定的冷冻保护液。

一种采用关节软骨冷冻保护液进行软骨冷冻保存方法，所述冷冻保存方法，包括淋洗、滴加部分冷冻保护液、加入剩余冷冻保护液、程序降温。