[发明专利]一种基于上转换发光标记的基因载体、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于上转换发光标记的基因载体的制备方法及应用，上转换发光标记的基因载体制备方法包括：通过配体交换法和静电层层自组装法，用多元酸和聚赖氨酸对纳米粒子进行包覆，构建了一种新型的上转换发光标记基因传递载体。多元酸和聚赖氨酸的包覆不仅使基因载体稳定地在水中分散，增加了基因载体转基因转染效率和扩大了基因转染的适用范围。

技术领域

本发明涉及纳米发光材料合成和生物医用材料，具体涉及一种新型的基于上转换发光的基因载体的制备方法、基因载体以及应用。

背景技术

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的一种生物医学新技术。相对于传统的治疗方法，基因治疗具有靶向性、高效性、副作用小等优点。基因治疗的关键是借助载体将治疗基因高效导入目的靶细胞以便于成功地实现基因疗法在临床上的应用。稀土掺杂的上转换发光材料容易制备、大小可控、表面易修饰、细胞毒性小，可以用来构建基因载体，用于基因治疗中。

聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)是目前公认的最为有效的阳离子聚合物基因载体。它有线型和树枝状两种结构，含有大量伯胺和仲胺，缓冲能力强，具有“质子海绵”效应，可以通过质子化提高溶酶体的pH值，对DNA起到良好的保护作用，同时还能帮助细胞结合和摄取，并促进DNA从体内逃逸和从载体中释放。它可以与表面带负电荷的DNA进行有效结合，其浓缩程度与N/P值(即PEI上的氨基与DNA上的磷酸基团的数量比值)有关。基于此，PEI成为了一种理想的非病毒基因载体，在理论研究中得到了广泛的关注，并应用于靶向细胞的转染实验和某些体内基因治疗。

发明内容

发明目的：本发明提供一种基于上转换发光标记的基因载体的制备方法，该方法用配体交换法和静电层层组装法在所得纳米粒子的表面进行多层羧基化和氨基化修饰，将多层修饰后的纳米粒子与基因或基因片段结合，制得了单分散的水溶性好的复合纳米粒子。本发明还提供了复合纳米粒子在基因载体中的应用。

技术方案：本发明第一方面提供了基于上转换发光标记的基因载体的制备方法，包括以下步骤：(1)将多元羧酸盐溶解在极性溶液中，得到多元羧酸盐溶液，向多元羧酸盐溶液中逐滴加入分散在环己烷中的上转换发光纳米粒子，搅拌反应，对上转换发光纳米粒子进行表面羧基化修饰，通过配体交换法，多元羧酸取代表面的油酸配体，得到表面羧酸化的上转换发光纳米粒子；(2)向步骤(1)得到的表面羧酸化上转换发光纳米粒子溶液中，加入聚赖氨酸溶液，搅拌反应，通过静电自组装的方法，得到表面修饰有聚赖氨酸的上转换发光纳米粒子；(3)重复步骤(1)，向多元羧酸盐溶液中逐滴加入将步骤(2)得到的上转换发光纳米粒子溶液，搅拌反应，再次进行表面羧基化修饰；(4)向步骤(3)得到的表面多羧酸修饰的上转换发光纳米粒子加入到聚赖氨酸水溶液，搅拌反应，得到上转换发光标记的基因载体。最终构建了上转换发光标记的基因传递载体。

基因载体需要水溶性、稳定性以及与细胞的相容性均需满足要求，此外对DNA的负载量均需达到要求，本发明中在上转换发光纳米粒子首先进行羧酸化修饰，增加了上转换发光纳米粒子的水溶性，且羧酸化的纳米粒子带有负电荷，可很好地与聚赖氨酸进行组装，且聚赖氨酸具有正电荷，可负载DNA，为了进一步提高经过上述两层修饰的上转换发光纳米粒子的负载量、水溶性以及生物相容性，本发明对上述纳米粒子进行再次羧酸化修饰和聚赖氨酸修饰，由于多层修饰提高了负载量和水溶性，但是稳定负载后的稳定性较差，而本发明的聚赖氨酸克服了上述问题，可与羧酸之间形成稳定的自主装纳米粒子，稳定性、水溶性和负载量均达到基因载体的需求。

优选地，步骤(1)中所述多元羧酸盐溶解在选自水、乙醇和乙二醇中的一种或两种极性溶剂中。

优选地，步骤(1)中所述多元羧酸盐所述多元羧酸盐为含有多个羧基的化合物，选自为柠檬酸盐或酒石酸盐中的一种或多种。