[发明专利]一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法。本发明从NCBI数据库中下载假单胞菌(61株)和非假单胞菌(38株)的全基因组序列，通过比较基因组的方法寻找假单胞菌属特异性基因，通过DNAMAN 8软件对特异性基因进行序列比对，寻找假单胞菌属特异性基因的保守片段，利用Oligo7软件设计仅能扩增假单胞菌属特异性基因的引物。本发明的特异性引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明的检测方法稳定性好，可用于生鲜肉中假单胞菌属细菌的定量检测。

技术领域：

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法。

背景技术：

假单胞菌是一种革兰氏阴性、专性需氧、无芽孢、非发酵杆菌。目前，假单胞菌属共有上百个种，包括铜绿假单胞菌群(铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌、假产碱假单胞菌等)、绿针假单胞菌群(绿针假单胞菌、草莓假单胞菌等)、荧光假单胞菌群(荧光假单胞菌、类黄假单胞菌等)、穿孔假单胞菌群(脱氮假单胞菌和穿孔假单胞菌)、恶臭假单胞菌群(恶臭假单胞菌、香鱼假单胞菌等)、施氏假单胞菌群(浅黄假单胞菌、施氏假单胞菌等)、丁香假单胞菌群(褐鞘假单胞菌、绿黄假单胞菌等)等，其中铜绿假单胞菌为代表菌种。

食品腐败主要是由食品本身存在的酶以及微生物产生的各种酶引发的。据报道，生鲜产品的腐败率超过35％，其中肉类和水产品占据了10％-15％，为我国的食品行业带来很大的经济损失(王永锋2012)。生鲜产品的腐败变质主要是由于微生物的代谢活动引起的(Kodogiannis,Pachidis et al.2014,Gopal,Hill et al.2015)，当微生物的数量达到一定值时则会引起食品的腐败(Jones 2004)，如感官颜色的变化、腐臭味、粘液等，研究表明假单胞菌属是新鲜肉类产品中主要的腐败菌，如荧光假单胞菌、草莓假单胞菌、恶臭假单胞菌等(Andreani and Fasolato 2017)。对肉类产品中的假单胞菌属进行快速检测，能够在合理的时间内采取措施以提高货架期，最大限度的减少生鲜肉的损失。

目前，对生鲜肉中腐败微生物的检测方法主要包括传统的培养方法、16S rDNA一代基因测序、高通量测序、荧光定量PCR等方法(Olsson,Ahrne et al.2003,Handelsman2004,Russo,Ercolini et al.2006,Broekaert,Heyndrickx et al.2011,Noseda,Islamet al.2012)。传统的培养方法可准确的鉴定并计数微生物的菌落数，但该方法只能鉴定可培养的微生物，后期需进行各种生化反应，耗时耗力。16S rDNA一代基因测序可鉴定出腐败微生物的种类，但是无法对微生物进行准确的定量。高通量测序技术可用于分析样本中微生物的多样性以及动态变化，通过该方法可确定样本中的优势微生物，但是仍无法对微生物进行计数。荧光定量PCR检测法既可以对微生物的种类进行定性检测，也可对微生物的数量进行定量检测。但是，目前对微生物的荧光定量PCR检测方法局限于种水平上的微生物，缺乏对属水平上的微生物的检测。造成食品腐败的微生物并非单一微生物作用的结果，而是多种微生物共同作用的结果，因此，对微生物进行属水平上的检测具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法。

本发明从NCBI数据库中下载假单胞菌(61株)和非假单胞菌(38株)的全基因组序列，通过比较基因组的方法使用Perl编程语言寻找假单胞菌属特异性基因，对特异性基因于NCBI数据库中进行比对验证基因的特异性，然后通过DNAMAN 8软件对假单胞菌属特异性基因进行序列比对，寻找假单胞菌属特异性基因的保守片段，利用Oligo7软件设计仅能扩增假单胞菌属特异性基因的引物，建立一种假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法，能够鉴定假单胞菌属细菌。

因此，本发明的第一个目的是提供一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列，所述的特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。