[发明专利]新型基因治疗载体pIRES-Rsirt2/4-Tet-nap的制备方法及应用

权利要求书

1.本发明构建了pIRES-Rsirt2/4-Tet-nap双基因共表达自噬载体，实现目的基因的外源质粒DNA载体在哺乳类细胞的高效可控表达；其沿载体转录方向依次连接有CMV启动子、R-Sirt2基因、IRES序列、R-Sirt4基因、HSV TK polyA序列、tTA序列、TRE序列和nap序列、Kana抗性基因以及PUC质粒骨架等元件。

2.根据权利要求1所述的pIRES-Rsirt2/4-Tet-nap双基因共表达自噬载体，其特征在于：所述sirtuin2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所述sirtuin4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.3所示，所述HSV TK polyA序列如序列表中SEQ ID No.4所示，所述tTA序列如序列表中SEQ ID No.5所示，所述TRE序列如序列表中SEQ ID No.6所示，所述nap序列如序列表中SEQID No.7所示。

3.根据权利要求1所述的pIRES-Rsirt2/4-Tet-nap双基因共表达自噬载体，其特征在于：在四环素诱导表达元件tTA和TRE的调控下启动nap序列由两个作用元件肽段组成，包括：

（1）分子伴侣自噬识别基序“KFERQ”序列：TTCAAACTTGCAGTT；

（2）DNA结合肽段(核酸肽)序列：TCGCAGA TCAAGTTGTC CATCAAGCGC CTGGTCACC，氨基酸序列为“SQIKL SIKRLVT”。

4.根据权利要求3所述的四环素诱导调控下启动nap序列由两个作用元件肽段组成，nap肽段的诱导表达可以自动结合质粒DNA并诱导分子伴侣的溶酶体自噬，从而外源的质粒DNA分子载体在细胞内自噬消失。

5.权利要求1所述的pIRES-Rsirt2/4-Tet-nap双基因共表达自噬载体的构建方法，其特征在于，步骤包括：

（1）获得含有特异性酶切位点的sirtuin2基因片段和sirtuin4基因片段；

（2）将步骤（1）得到的sirtuin2基因片段和sirtuin4基因片段连接于载体，构建含有sirtuin2-IRES-sirtuin4基因的重组载体；

（3）将步骤（2）构建的含有sirtuin2-IRES-sirtuin4基因的重组载体与pTet-On和pTRE-Tight载体通过双酶切连接，获得含有sirtuin2-IRES-sirtuin4-rtTA-TRE的载体；

（4）将合成的nap序列插入含有sirtuin2-IRES-sirtuin4-rtTA-TRE的载体，构建所述的pIRES-Rsirt2/4-Tet-nap双基因共表达自噬重组载体。