[发明专利]新型基因治疗载体pIRES-Rsirt2/4-Tet-nap的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种pIRES‑Rsirt2/4‑Tet‑nap重组质粒，其沿载体转录方向依次连接有R‑Sirt2基因、IRES序列、R‑Sirt4基因、HSV TK polyA序列、tTA序列、TRE序列和nap序列，或者反向连接。其中，R‑Sirt2和R‑Sirt4基因的功能是重构线粒体网络并逆转衰老细胞表型；IRES序列则是连接sirtuin2基因和sirtuin4基因，使两者反向共表达；tTA和TRE是四环素诱导表达元件，调控DNA结合和分子伴侣介导自噬的肽段nap序列表达。本发明所述的自噬重组载体，采用IRES序列连接sirtuin2和sirtuin4基因，能在同一载体中共表达Sirtuin2和Sirtuin4蛋白，表达后由四环素元件调控质粒DNA细胞内自噬。故该重组质粒可用于基因治疗线粒体功能障碍相关疾病的药物中的应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种能重构线粒体网络并逆转衰老细胞表型的重组载体及其制备方法和应用。

背景技术

随着人们对IRES结构和功能研究的不断深入，利用IRES结构研究疾病治疗药物、构建可转入细胞内的病毒模型，以及在基因治疗方面的应用越来越多。经过查询专利，我们发现如今IRES在构建载体上得到了非常广泛的应用。IRES (internal ribosome entrysite)序列是1988年分别由Nahum Sonenberg和Eckard Wimmer实验室在脊髓灰质炎病毒(PV)和脑心肌炎病毒(EMCV)的RNA基因组中发现的。IRES通常位于RNA病毒的5'UTR中，允许RNA以5'帽子非依赖性方式翻译。利用IRES连接两个基因，在上游启动子的控制下，IRES和两个基因转录成为同一条mRNA。翻译时，IRES上游基因翻译起始遵循真核生物基因的帽依赖性方式，而下游基因则通IRES招募核糖体进入起始基因的翻译，实现了IRES序列连接的两个基因共用同一个转录单位表达。

目前利用IRES为靶点进行的药物研究主要集中在丙型肝炎病毒感染的治疗药物。Dash等证实IFN.II、IFN.B和IFN-t能够靶向作用于HCV的5’端IRES，抑制蛋白的翻译。Prabhu等证实靶向于IRES颈环结构II的siRNA能够在体外抑制HCV的六个基因型，因此颈环结构II可以作为抑制HCV的靶点研究药物。Ray等找到一种与IRES颈环结构11I相对应的的RNA分子，能够剂量依赖的抑制IRES介导的翻译，而对帽结构依赖的翻译无作用。颈部和第四环(SLrV)区域、起始密码子附近的GCAC序列，对于介导核糖体在HCV RNA上的聚集具有重要功能，Subramanian等实验证实了短发夹结构sh.SLIV在Huh7细胞中对HCV RNA的复制起到显著的抑制作用。Das等已经发现一种小的酵母RNA能够特异地抑制脊髓灰质炎病毒(PV)IRES介导的翻译。同时这种IRNA能够在体内和体外特异抑制HCV IRES介导的翻译，能够竞争La自身抗原与HCV IRES的结合，这为抗HCV感染研究药物提供了新的基础。根据IRES结构的特点，针对结构域II、结构域III-IV和结构域IV设计了不同的RNA适配子，均证实具有抑制IRES介导翻译的活性。另外，能够靶向性抑制IRES活性的还有人工核糖核酸酶、DNAzyme(Dz)分子、反义寡核苷酸、合成肽(LAP)、肽核酸(PNA)等，这些分子的研究为抗HCV病毒药物研究奠定了基础。