[发明专利]一种快速鉴定乳酸菌的质谱方法

说明书

本发明公开了一种快速鉴定乳酸菌的质谱方法，包括对乳酸菌的基质辅助激光解吸离子飞行质谱处理，处理过程包括：微生物细胞破碎、微生物蛋白质提取、质谱条件的优化与数据库分析，本发明消除了现有技术中对乳酸菌的检测存在的成本较高、可靠不稳定的问题，本方法实现了用质谱的方法快速鉴定乳酸菌，并在鉴定结果的基础上获得有效的蛋白质指纹图谱数据和差异性及共性的分析数据，不仅对乳酸菌的快速鉴定打开实用大门，也为乳酸菌的蛋白质分析与应用提供理论保障。

技术领域

本发明涉及化学方法鉴定微生物，具体是一种快速鉴定乳酸菌的质谱方法。

背景技术

MALDI-TOF MS(基质解吸电离飞行时间质谱Matrix-Assisted LaserDesorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)一种软电离有机质谱，通过脉冲激光把分析物从含有强紫外线吸收物质的固态基质释放出来，从而产生带单电荷的分子或离子，在检测器上产生放大电流可以作为时间函数用来测定离子丰度和其质量与电荷的比 (质核比m/z)。微生物核蛋白质体系主要受遗传因素控制，培养基组份及培养时间等外部因对其素影响较小，具有一定的特异性[2]，可以通过微生物的特征性谱峰，通过检索特征性质谱峰数据库或与已知微生物的质谱峰比较，达到对微生物进行快速检测、鉴定和分型的目的。但从遗传学的角度看,核酸虽决定蛋白的表达，但蛋白质的丰度受翻译效率和其他蛋白后修饰等影响，因此，微生物蛋白质水平获得信息较核酸水平的分析可获得更多。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类能用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称的细菌的通称。乳酸菌适应生长的pH范围很广，但有些作为胃肠道改善益生乳酸菌，可耐受胃酸的高酸度，直达肠道[4]。乳酸菌现有的鉴定方法为生化方法，分子方法鉴定。乳酸菌的理化检验方法依据的是《食品安全国家标准微生物学乳酸菌检验》GB4789.35以及《食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌鉴定》GB4789.34当中规定的乳酸菌生化反应指标进行鉴定，鉴定中需要使用单菌落革兰染色镜检方式。此种鉴定方式，鉴定结果存在较大的不稳定性，且能够鉴定的结果较少。表型特征鉴定方法是具有长久使用历史的乳酸菌鉴定方式，依据的是不同菌种在形态结构、生化理化反应及代谢产物上的差异性，直观快速地明确乳酸菌分属类型。此类鉴定方法由于鉴定成本较低，在食品工业当中应用范围较广、应用时间较长，鉴定时多数只能够鉴定到乳酸菌的所属，对具体种类鉴定不足，鉴定的可靠性较差，并且只有通过一定的重复鉴定工作才能够明确乳酸菌的具体种类。

乳酸菌蛋白质多样性的鉴定方法为SDS-PAGE鉴定方法，能够通过对乳酸菌整个细胞蛋白质分析，准确鉴定乳酸菌的种类，但该鉴定方法的操作较为复杂，鉴定的效率较低，难以大范围推广实施。

基因鉴定乳酸菌的方法优势是结果不会受到乳酸菌培养环境的影响，有力地提升了鉴定的准确性与科学性，同时，利用不同的基因鉴定方式能够展现出不同的分类标准和水平。在PCR技术基础上衍生出来的多重PCR技术，实时定量PCR技术、RFLP技术，是乳酸菌鉴定的有效方式之一。RFLP鉴定方法具有较高的分辨率，但也存在重复性差、鉴定种类不够深入的缺陷。在乳酸菌基因鉴定方法中，16SrDNA与16SrRNA序列测定方法是鉴定未知菌类的有效方式，同样还是目前乳酸菌鉴定方法中准确性较高的一种方式。鉴定过程中首先鉴定人员要对待检的乳酸菌实施16SrDNA与16SrRNA特异性扩增，随后测量出乳酸菌的核苷酸序列，在此基础上，将获得的基因序列与已明确的乳酸菌序列进行比对，进而明确鉴定乳酸菌的种类。此种鉴定方法在乳酸菌鉴定准确性与精确性上具有较为显著的优势，能够将乳酸菌鉴定划分到种的水平。但是，此鉴定方法所需的鉴定成本较高，并且鉴定过程较长，在经济性与效率性上有待提升。DGGE技术与TGGE技术在微生物群体鉴定研究方面具有较为显著的优势，可以将其应用于特定群落菌类的鉴定中，通过对特定菌落进行特异性扩增，获取细菌群落的相关信息，进而反映整个发酵过程的真实情况，分子鉴定都基于在微生物在基因水平的一致性，但其特异性仍需要更多的分子学实验的支撑。