[发明专利]基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法

权利要求书

1.基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)细胞培养：

设三管；第一管为阴性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入CD28和CD49d，使培养基中CD28和CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.4～0.6mL肝素抗凝的外周血；第二管为阳性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入PHA、CD28和CD49d，使培养基中PHA浓度为9～11ug/mL和CD28、CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.4～0.6mL肝素抗凝的外周血；第三管为测定管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入ESAT-6、CFP-10、CD28、CD49d，使培养基中ESAT-6和CFP-10浓度各为4.5～5.5ug/mL，CD28和CD49d浓度各为0.9～1ug/mL后，再加入0.4～0.6mL肝素抗凝的外周血；

把阴性对照管、阳性对照管和测定管放入36～38℃、4～6％CO₂培养箱中培养20～24小时；

2)多色免疫表型标记与流式细胞术检测：从培养的3管全血中各取45～55uL分别加入到三根流式管中，然后，每根流式管中加入CD3-APC、CD4-PC5、CD25-PerCP、CD134-FITC各4～6uL，常温避光15～20min；加NH₄Cl溶血素400～450ul，轻微振荡混匀；调整流式细胞仪中前向与侧向散射光的电压，根据CD4-CD3设门，取CD4⁺CD3⁺细胞分析CD25⁺CD134⁺群细胞百分率，测定结果为测定管的CD25⁺CD134⁺群细胞百分率－阴性对照管的CD25⁺CD134⁺群细胞百分率。

2.基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)细胞培养：

设三管；第一管为阴性对照管：在含10％小牛血清的1640细胞培养基中加入CD28和CD49d，使培养基中CD28和CD49d浓度各为1ug/mL后，再加入0.5mL肝素抗凝的外周血；第二管为阳性对照管：在含10％小牛血清的1640细胞培养基中加入PHA、CD28和CD49d，使培养基中PHA浓度为10ug/mL和CD28、CD49d浓度各为1ug/mL后，再加入0.5mL肝素抗凝的外周血；第三管为测定管：在含10％小牛血清的1640细胞培养基中加入ESAT-6、CFP-10、CD28、CD49d，使培养基中ESAT-6和CFP-10浓度各为5ug/mL，CD28和CD49d浓度各为1ug/mL后，再加入0.5mL肝素抗凝的外周血；

把阴性对照管、阳性对照管和测定管放入37℃、5％CO2培养箱中培养24小时；

2)多色免疫表型标记与流式细胞术检测：从培养的3管全血中各取50uL分别加入到三根流式管中，然后，每根流式管中加入CD3-APC、CD4-PC5、CD25-PerCP、CD134-FITC各5uL，常温避光15min；加NH₄Cl溶血素400ul，轻微振荡混匀；调整流式细胞仪中前向与侧向散射光的电压，根据CD4-CD3设门，取CD4⁺CD3⁺细胞分析CD25⁺CD134⁺群细胞百分率，测定结果为测定管的CD25⁺CD134⁺群细胞百分率－阴性对照管的CD25⁺CD134⁺群细胞百分率。

3.根据权利要求2所述的基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所设的三管中，含10％小牛血清的1640细胞培养基的用量为0.5mL。