[发明专利]基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法

说明书

本发明涉及基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法，包括首先对细胞的培养和刺激，接着进行多色免疫表型标记，再用流式细胞术检测CD4⁺T淋巴细胞经结核特异性抗原ESAT‑6和CFP‑10刺激后，其细胞表型CD25⁺CD134⁺的表达增加。本发明的方法有着操作简单的优点，且还增加了诊断的灵敏度和缩短了检测时间，适合在结核病的检测中推广。

技术领域

本发明涉及医学检测领域，特别涉及基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一种与机体细胞免疫密切相关的慢性传染病，严重威胁着人类健康。近年来，随着MTB耐药株的不断增加与播散，以及卡介苗预防下降，结核病在全球呈明显回升趋势，流行情况日益严峻。中国是结核病的重灾区，结核病发病人数占全球的11.36％，位居全球第二。MTB感染人体后，根据个体的免疫情况，可以发生三种结局:第一种结局是个体免疫力旺盛，直接将感染的MTB杀死；第二种是机体免疫力不足以杀死全部MTB，但能抑制MTB的大量增殖，使之达到平衡状态，从而导致潜伏性结核感染；第三种是机体的免疫力过低导致MTB大量增殖，引发临床疾病。据估计，世界上有近1/3的人口感染结核杆菌，其中只有5％～10％左右的人会发病，其余90％～95％的人群处于潜伏感染。然而，在机体免疫功能紊乱时，可导致LTBI转变为活动性结核病。因此，结核患者尤其是LTBI患者高效及时的结核早期诊断是结核规范性治疗的起点。

结核病的实验室诊断技术一直是结核病防控的瓶颈。现有诊断手段包括病原学诊断如MTB分离培养、涂片镜检和分子检测诊断等方法。但上述方法都有各自局限，如MTB分离培养耗时长(一般需要6～8周)，灵敏度不高，且存在生物安全风险，仅在结核病定点医院开展。涂片镜检敏感度低(只有20％～30％的阳性率)，且不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，往往延误治疗。分子诊断操作复杂，且结核杆菌的生物学特性，该方法的灵敏度和特异性不能满足临床需求。以上这些方法都需要从感染部位获取标本如痰、胸水、腹水、脑脊液等，但对于痰涂片阴性或病原学检查阴性，而临床又高度怀疑结核；尤其是无法获取病灶标本如骨结核、肠结核等，对结核病的诊断和排除诊断急需一种新的实验室检查方法，免疫学诊断应运而生。近年来，科学家通过比较基因组学发现了结核分支杆菌具备而卡介苗和其他分支杆菌没有的基因区域，且位于此区域的两个蛋白早期分泌抗原-6(ESAT-6)和培养基滤过蛋白-10(CFP-10)具有较强的Th表位。在此基础之上，结合T细胞免疫检测技术的进展建立了一种新型的结核特异性T细胞免疫体外检测方法——基于酶联免疫斑点技术的结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB)和基于酶联免疫吸附技术的T淋巴细胞γ-IFN体外释放试验(IGRA)。

T-SPOT.TB和IGRA的原理基本一致，均为机体对MTB感染后发生的细胞免疫反应。利用特异性的结核抗原ESAT-6和CFP-10作为刺激原，经过全血中的抗原递呈细胞刺激特异性Th细胞产生IFN-γ，于37℃体外培养16-24小时后检测产生IFN-γ的淋巴细胞数量(T-SPOT.TB)或培养液中IFN-γ含量(IGRA.TB)，判断全血中是否存在结核特异性T细胞及其活力。由于采用结核菌特有抗原作为刺激原，不受卡介苗和非结核分枝杆菌的影响，对结核感染的检测灵敏度和特异性均较高。