[发明专利]一种高效发酵生产甾药前体的方法

说明书

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体的方法。本发明将通过过表达Ⅱ型NADH脱氢酶基因提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体，以解决微生物法甾药前体生产时存在的发酵周期长、生产效率低的问题，为甾药前体生产成本的降低提供新方法。

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体的方法。

背景技术：

甾体药物简称甾药是制药工业中主要销售的产品并在临床上被广泛用。已知植物甾醇可被许多微生物分解代谢为一系列甾药前体。其中，4-雄甾烯-3,17-二酮(AD)和1,4-雄甾烯-3,17-二酮(ADD)是合成类固醇药物如孕激素，避孕药和雌激素的主要前体。据报道，快速生长的土壤分枝杆菌具有较强的降解植物甾醇侧链积累AD和ADD的能力。作为化学合成的替代，生物转化已成为制药工业中生产甾药前体的主要生产方法。但无论是原始菌株还是工程菌株均具有较长的转化周期(≥5天)，且在转化中后期(3天之后)菌株的活力明显下降，并伴随转化效率的急剧降低。这也是造成甾药前体生产成本高昂的原因之一。

发明内容：

针对上述问题，本发明将通过提高甾药生产菌株活力高效发酵生产甾药前体，以解决微生物法甾药前体生产时存在的发酵周期长、生产效率低的问题，为甾药前体生产成本的降低提供新方法。

本发明实现上述目的的技术方案之一，是通过构建Ⅱ型NADH脱氢酶加强的甾药前体基因工程生产菌株，从而提高菌株细胞活力，高效发酵生产甾药前体；

所述基因工程生产菌株是以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3为宿主细胞，以pMV261质粒为表达载体，过表达Ⅱ型NADH脱氢酶基因获得的；

所述Ⅱ型NADH脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示，来源于快速生长型分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3,保藏编号CICC 21097；

本发明所提供的技术方案之二，是上述基因工程生产菌株的应用；

进一步的，上述基因工程生产菌株应用于普通发酵生产AD的方法如下：

将上述基因工程生产菌株的种子液按2-10％(种子液与废弃油+发酵培养基的体积比)的接种量转接于含5-20％(体积比)废弃油的发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养24-168h，AD产量达到0.5-25g/L，摩尔转化率可以达到50％-99％；

进一步的，上述基因工程生产菌株应用于分批发酵生产AD的方法如下：

将上述基因工程生产菌株的种子培养液以2-20％的接种量转接于含5-20％(体积比)废弃油的发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养5天(首批次)；

首批次发酵结束后进行重复分批发酵，在每批发酵结束时取出50-90％的培养物并补充等量的新鲜高压灭菌发酵培养基和废弃油，取出部分用于产物提取；除首批次外，剩余批次发酵时间为3天，所有培养批次在相同的培养条件下进行，共进行五批发酵，五批发酵后AD产量达到0.5-25g/L，摩尔转化率可以达到50％-99％；

所述的废弃油包括但并不限于过期的动植物油商品，食品、餐饮行业煎炸使用后废弃的动植物油以及地沟油处理后的上清油。

所述发酵培养基组成：K₂HPO₄ 0.1-3g/L，MgSO₄ 0.1-3g/L，柠檬酸铁铵0.01-0.2g/L，柠檬酸1-5g/L，磷酸氢二铵1-10g/L，葡萄糖5-50g/L，植物甾醇1-50g/L，其余为水，pH6.0-7.5。

有益效果：