[发明专利]用于检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒荧光定量PCR的方法及相应试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分鳜鱼传染性脾肾坏死病毒与其它种属的菌种或病毒，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。

背景技术

传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)属于虹彩病毒科中的细胞肿大病毒属，成熟病毒粒子为二十面体，直径为100nm-150nm，基因组为双链DNA，成熟病毒粒子一般由囊膜、电子非致密区和核心组成。通过内吞方式入侵鳜鱼体内，附着在脾脏组织细胞上，导致器官内出现大量嗜碱性的、细胞质匀质化的、直径约15μm～20μm的肿大细胞。

鳜鱼(Siniperca chuatsi)肉质细嫩、味道鲜美，是我国优质的淡水鱼品种之一，自从鳜鱼人工养殖技术获得成功之后，鳜鱼养殖业逐渐发展壮大，但是随着鳜鱼养殖规模和密度逐年提高，鳜鱼疾病增多，特别是传染性脾肾坏死病毒的流行，该病是鳜鱼养殖中的主要病害，其发病率高达60％以上，死亡率达50％以上，严重影响了鳜鱼产业的健康发展。

感染传染性脾肾坏死病毒的鳜鱼其头、下颌、鳃盖、腹部和尾鳍等部位有出血点，鳃盖粘液增多，脾脏肿大充血坏死，出现空洞，并有大量白细胞浸润，肾小管和肾小囊的血管球萎缩，从而导致病鱼贫血、多器官衰竭而死亡。

目前，对ISKNV的检测方法，有病理解剖法、电镜观察法、PCR检测和核酸探针原位杂交法，但是由于上述方法操作复杂、耗时长，一般只能在分子实验室确诊，无法满足快速、简单和灵敏的检测。荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高，并且能定性或定量检测病害，是目前公认的最准确、快速的病害检测手段，目前，尚未针对ISKNV的保守序列，建立系统的ISKNV的QPCR诊断技术，本发明通过对ISKNV全基因组序列比对分析，找到了三个保守序列ATPase、MCP和IRB6，设计高特异性的引物探针，对ISKNV进行定性或定量检测，对鳜鱼病原的诊断和防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR方法。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、利用荧光定量PCR检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒特异性基因ATPase、MCP和IRB6基因；

S4、读取扩增Ct值；当所述鳜鱼传染性脾肾坏死病毒特异性基因中至少1个基因的Ct值小于35时，鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测结果为阳性；当所述鳜鱼传染性脾肾坏死病毒特异性基因ATPase、MCP和IRB6基因的Ct值均大于35时，鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述鳜鱼传染性脾肾坏死病毒特异性基因ATPase的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1(5’-GCGGCAAGTCGGTGCTA-3’)；

SEQ ID NO:2(5’-CGGCCGCGGGAATTA-3’)。

TaqMan探针序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:3(5’-FAM-ATCATTGCGGCCAAGCGGCAC-BHQ1-3’)；