[发明专利]一种3α羟类固醇脱氢酶突变体及其在总胆汁酸检测中的应用

权利要求书

1.一种活性和稳定性提高的3α羟类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，在野生型睾酮丛毛单胞菌3α羟类固醇脱氢酶的氨基酸序列的52位、76位、124位、137位、169位以及228位进行了替换修饰，分别为Ⅰ52V，T76A、K124E、A137S、R169C、F228L，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种分离的表达3α羟类固醇脱氢酶突变体的核酸，其特征在于，序列为SEQ ID NO：2所示，能够编码如权利要求1所述蛋白。

3.一种表达载体，其特征在于，含有如权利要求2所述的核酸序列。

4.一种表达细胞，含有如权利要求3所述的表达载体，并能表达如权利要求1所述的氨基酸序列的蛋白。

5.一种使用如权利要求1所述突变体酶的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，包括试剂1和试剂2，其中试剂1的组成成分包括：Thio-NAD、缓冲液1、表面活性剂、稳定剂1和去干扰剂；试剂2的组成成分包括：如权利要求1所述序列的3α-HSD突变体、还原型辅酶Ⅰ、表面活性剂、缓冲液2和稳定剂2。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，试剂1的组分为：所述缓冲液1为二甲胂酸钠盐酸缓冲液；所述表面活性剂为Pluronics L31；所述稳定剂1为CaC1₂和EDTA.2Na按照质量比1：1混合制成；所述去干扰剂为草氨酸钠；所述缓冲液2为pH7.5的巴比妥钠-盐酸缓冲液：所述稳定剂2为半胱氨酸；在所述试剂1中，Thio-NAD的浓度为2-3mmo1/L；缓冲液1的终浓度为75mmo1/L；表面活性剂的浓度按质量体积百分含量计为3.5％；稳定剂1的浓度为5g/L：去干扰剂的浓度为5mmol/L；在所述试剂2中，3α-HSD的浓度为8-17KU/L；还原型辅酶1的浓度为5g/L；缓冲液2的终浓度为25mmo1/L；表面活性剂的浓度以质量体积百分含量计为7.0％；稳定剂2的浓度为5g/L。