[发明专利]一种3α羟类固醇脱氢酶突变体及其在总胆汁酸检测中的应用

说明书

一种3α羟基类固醇脱氢酶突变体及其在总胆汁酸循环酶法检测中的应用,其特征在于将3α羟基类固醇脱氢酶野生型的氨基酸序列的第52位、76位、124位、137位、169位以及228位进行了替换修饰，分别为I52V、T76A、K124E、A137S、R169C、F228L，该突变体具有极高的稳定性，包括pH和温度的稳定性，使用本突变体酶制备的总胆汁酸循环酶法试剂盒具有极高的稳定性。

技术领域

本发明涉及医疗诊断领域，具体涉及一种活性和稳定性提高的3α羟类固醇脱氢酶突变体和使用这个突变体酶的人血清总胆汁酸检测试剂盒。

背景技术

3α-羟类固醇脱氢酶（3α–Hydroxysteroid dehydrogenase，3α-HSD），可作用于多种类固醇基质，可逆地催化C_19~27类固醇3 位羟基/酮基的氧化还原。临床上用3α-HSD 作为工具酶来测定人血清中的总胆汁酸（Total bile acids，TBA）浓度。目前，TBA 测定中所用的工具酶3α-HSD 均从睾酮丛毛单胞菌中直接提取，但提取过程复杂、酶蛋白得率低，酶的稳定性低，在一定程度上限制了TBA 测定的临床推广。因此，要使3α-HSD广泛应用于临床医学中，一方面需要寻求更简单高效的提取纯化方法，另一方面必须要提高3α-HSD酶的催化活性、稳定性。

3α羟类固醇脱氢酶是睾酮丛毛单胞菌分泌的一种类固醇脱氢酶，由257个氨基酸残基构成，理论分子量为26.4kDa，可作用于多种类固醇基质，可逆地催化C_19~27类固醇3位羟基/酮基的氧化还原。胆汁酸是3α-HSD 的作用底物之一，临床上用3α-HSD作为工具酶来测定人血清中的总胆汁酸浓度。

定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的基因，通过改进的诱变技术改造的酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的天然酶。近10年来，定向进化技术已经在酶性质改造领域取得巨大的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题而提供。

本发明通过以下技术方案实现：一种高活性和宽pH范围及温度稳定性的3α-羟类固醇脱氢酶变体，由亲本睾酮丛毛单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶进行定向进化，通过易错PCR、DNA Shuffling和定点突变，获得3α-羟类固醇脱氢酶突变体，亲本睾酮丛毛单胞菌氨基酸序列SEQ ID NO 2中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示3α-羟类固醇脱氢酶突变体中突变的氨基酸，所述3α-羟类固醇脱氢酶突变体为3α-羟类固醇脱氢酶氨基酸突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，在野生型酶的序列上有6个突变氨基酸，分别为 I52V、T76A、K124E、A137S、R169C、F228L。

本发明提供了一种总胆汁酸测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂1和试剂2，其中，试剂1的组成成分包括：Thio-NAD、缓冲液1、表面活性剂和稳定剂1；试剂2的组成成分包括：3α-HSD突变体酶、还原型辅酶Ⅰ、表面活性剂、缓冲液2和稳定剂2；

其中，所述缓冲液1选自由邻苯二甲酸氢盐缓冲液，酒石酸盐缓冲液，草酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、PIPES哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、二甲胂酸钠盐酸缓冲液所组成的组中的一种；

所述缓冲液2选自由硼酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液所组成的组中的一种。

可选的，所述表面活性剂选自由Pluronics、PEG-PCL、PEG-PLA和PEG-PLGA所组成的组中的一种或两种；所述稳定剂1选自由NaCl、CaCl2、MgSO4、EDTA.2Na和EDTA.2K所组成的组中的一种或多种。