[发明专利]一种研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的方法包含：

步骤1、将脐带两端去除，并清洗脐带动静脉中的血渍；

步骤2、将脐动脉和脐静脉剔除，将脐带剪成小块，剥离出来胶层，剪成更小的块状；

步骤3、将组织块分装入离心管，用组织研磨机将组织研磨成肉糜；

步骤4、用胶原蛋白酶和胰蛋白酶与肉糜悬液混合，置于摇床中震荡；

步骤5、再用培养基中和后，离心去上清，再与培养液混合，加入细胞培养瓶中；

步骤6、静置培养，然后用酶消化，再进行传代培养；

步骤7、继续培养一段时间后，P1代再进行传代培养，P2代冻存。

2.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤1中，用含有庆大霉素和双抗的生理盐水清洗脐带动静脉中的血渍。

3.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤2中，将两根脐动脉和一根脐静脉剔除，将脐带剪成长度为1cm的小块，剥离出来胶层，剪成直径为3mm的小块。

4.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤3中，将组织块分装入15ml离心管，每管内的装入体积为2ml，调节组织研磨机的转速为800rpm，研磨1min，通过组织研磨机将组织研磨成肉糜。

5.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤4中，用含有10mg/ml胶原蛋白酶的质量百分比为0.125％的胰蛋白酶与肉糜悬液按体积比1:10混合，置于37℃的摇床中震荡5min。

6.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤5中，用培养基中和后，以1200rpm/min的转速离心5min，去上清，再与培养液混合，所得的细胞悬液加入T225瓶中，每个T225瓶中加入50ml细胞悬液。

7.如权利要求6所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤5中，采用无血清DMEM培养基中和后，离心去上清。

8.如权利要求6所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤5中，离心去上清后与培养液混合，所述的培养液为DMEM/F12加10％FBS的培养基。

9.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤6中，静置培养1周，待细胞爬出融合度为80％的时候，按质量百分比计用含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶，进行1传6的消化传代。

10.如权利要求1所述的研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤7中，继续培养5天后，P1代再进行1传6的传代培养，P2代冻存。