[发明专利]一种研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法

说明书

本发明公开了一种研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法，其包含：步骤1、将脐带两端去除，并清洗脐带动静脉中的血渍；步骤2、将脐动脉和脐静脉剔除，将脐带剪成小块，剥离出来胶层，剪成更小的块状；步骤3、将组织块分装入离心管，用组织研磨机将组织研磨成肉糜；步骤4、用胶原蛋白酶和胰蛋白酶与肉糜悬液混合，置于摇床中震荡；步骤5、再用培养基中和后，离心去上清，再与培养液混合，加入细胞培养瓶中；步骤6、静置培养，然后用酶消化，再进行传代培养；步骤7、继续培养一段时间后，P1代再进行传代培养，P2代冻存。本发明基于组织研磨法与消化结合的方法，能够大大提高原代细胞得率，减少细胞损伤。

技术领域

本发明涉及一种用于哺乳动物细胞基因工程领域的提取方法，具体地，涉及一种能够有效地研磨与混合酶结合的提取脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

脐带间充质干细胞是存在于新生儿脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种间充质干细胞。来源于脐带的间充质干细胞因其取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，分泌细胞生长因子的总量也非常高，有利于皮肤组织损伤修复及皮肤过敏问题解决，基于此的药妆产品开发研究不断深入及干细胞产业逐渐大规模化和商业化。

具体而言，脐带间充质干细胞培养大多使用贴壁法，将脐带剪成小块贴于培养皿表面，贴壁一周左右，代细胞爬出长满后消化传代，这一方法耗时较长通常需要一个月左右时间才能进行第一次传代操作，其中最常见的问题是组织贴壁不牢，容易脱落，细胞爬出较少，原代培养时间过长使细胞老化，状态变差，使用效果变差等；贴壁法工程量巨大，例如一根脐带在P1代是细胞数量达10亿，由于贴壁不完全，大大增加操作难度，由于爬出细胞分化程度和分裂不一，容易在后期造成细胞质地不均一，影响细胞的质控和使用；贴壁法造成生产成本问题是，原代培养时间较长，耗费培养液和血清较多，使成本大大增加。

通常的酶消化法，通常是采用胶原蛋白酶和胰蛋白酶结合消化脐带的沃顿胶组织细胞进行培养，由于脐带组织表面较湿滑，剪碎较困难，经常时间剪碎操作后，多数仍为肉眼可见的组织小块，而胰蛋白酶是通过解离细胞间糖蛋白和黏蛋白来分离细胞的，消化过度容易对细胞造成损伤，损坏细胞膜，破坏细胞骨架影响细胞后续增殖和分化，酶作用于组织块表面，经常导致表面组织细胞消化过度而组织内部细胞仍接触不到消化液，导致消化法提取间充质干细胞得率低，细胞活性不佳，难以增殖到理想数目。

在需要大量制备脐带间充质干细胞时，多采用消化的方式进行原代细胞的提取和制备，由于个体差异，消化酶对组织的浸润及消化速率很难把控，组织表面消化过度会造成细胞大量损伤，原代获取细胞量少，给细胞扩增增加难度，细胞扩增后状态和活性变差，破坏细胞壁结构，影响细胞贴壁。

综上所述，脐带间充质干细胞大规模培养，原代使用贴壁法，贴壁不牢，培养时间较长，细胞状态变老，爬出细胞状态不均一，使用效果变差；且贴壁法工程量巨大，耗费较多的人力和物力，成产成本较高；脐带间充质干细胞大量培养采用常规消化法，酶作用于组织块表面，经常导致表面组织细胞消化过度而组织内部细胞仍接触不到消化液，导致消化法提取间充质干细胞得率低，细胞活性不佳，细胞壁被破坏，贴壁程度低，细胞状态差，难以增殖到理想数目，严重影响后期扩增与诱导或基因改造工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种适于大规模培养脐带间充质干细胞的原代提取方法，针对现有的脐带间充质干细胞原代提取技术存在的诸多缺陷，基于组织研磨法与消化结合的方法，能够大大提高原代细胞得率，减少细胞损伤。