[发明专利]液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法

说明书

本发明公开了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，其步骤为：将活化后的枯草芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中，进行摇床培养，得种子液；将种子液接种于发酵罐深层的液体发酵培养基中，进行发酵培养，得到液体发酵产物；将液体发酵产物接种于多孔性浅盘固体发酵培养基中，进行浅盘固体发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵物；将枯草芽孢杆菌发酵物通风干燥后粉粹即得枯草芽孢杆菌菌剂。本发明利用廉价碳氮源作为培养基结合液固双相发酵工艺生产枯草芽孢杆菌菌剂，提高有效活菌数与芽孢得率，降低菌剂的原料与后处理成本。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体来说，涉及一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法。

背景技术

芽孢杆菌是一类能形成芽孢(内生孢子)的杆菌，广泛分布于土壤、水、空气以及动物肠道等处，大多数芽孢芽孢具有无毒、对人畜无害、不污染环境、能够分泌抗菌蛋白、抗生素、酶、多肽或脂类等活性物质，可促进植物生长与防治植物病害，并具有繁殖速度快、营养简单、抗逆性强、定植与繁殖能力强等优点，因此成为研究最多的农用益生细菌，其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌的一种。

研究表明，枯草芽孢杆菌具有产生广谱抗菌活性物质、与病原菌营养竞争和诱导植物系统抗性等生防作用以及促进植物生长的作用。目前枯草芽孢芽孢杆菌在烟草、油菜、辣椒、黄瓜等作物土传病害的防治与促生、增产、提质上效果显著，因此枯草芽孢杆菌是一种具有生物农药与生物肥料开发价值的一类芽孢杆菌，拥有广阔的应用前景。

当前，国内外生产枯草芽孢杆菌菌剂方法主要包括液体深层发酵与纯固体发酵。其中，液体深层发酵存在生产成本高、难以得到高密度的活菌与芽孢、代谢物不能充分利用、后续处理复杂(如发酵液真空浓缩，固态粉剂载体的吸附，干燥等)、有废液排放等弊端，而纯固体发酵由于多级固体扩种增加染菌风险且工艺复杂、发酵发酵周期长，因此不适合推广使用。如何在保证有效活菌数的同时，尽可能提高芽孢率，同时兼顾生产成本，成为困扰枯草芽孢杆菌菌剂实际工业生产的瓶颈问题。

发明内容

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法旨在利用廉价碳氮源作为培养基结合液固双相发酵工艺生产枯草芽孢杆菌菌剂，提高有效活菌数与芽孢得率，降低菌剂的原料与后处理成本，为建立规模化的发酵工艺提供参考依据。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，包括如下步骤：

S1、将活化后的枯草芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中，进行摇床培养，得种子液；

S2、将所述种子液接种于发酵罐深层的液体发酵培养基中，进行发酵培养，得到液体发酵产物；所述液体发酵培养基配方为：8～14g/L玉米粉、10～ 25g/L黄豆粉、1～4g/LNaCl、0.5～1.5g/L KH₂PO₄、0.5～2g/L K₂HPO₄、1～ 5g/L MgSO₄·7H₂O、1～5g/L CaCO₃、初始pH 6.5～7.5；

S3、将液体发酵产物接种于多孔性浅盘固体发酵培养基中，进行浅盘固体发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵物；所述浅盘固体发酵培养基配方为： 50～85份麦麸、4～15份豆粕粉、5～15份棉籽粕、3～10份玉米秸秆粉、 3～10份谷壳、1～5份糖蜜、0.1～0.5份(NH₄)₂SO₄、0.5～2份 MgSO₄·7H₂O、0.02～0.06份MnSO₄，调节水分至55～70％；