[发明专利]一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法

权利要求书

1.一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）构建重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K –MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI；

所述P450融合酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；脂酰CoA合成酶基因FadK的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；脂酰CoA脱氢酶基因MCAD的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

（2）利用步骤（1）制得的重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K –MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI，构建pBbB5K-ydiI-MCAD- FadK- P450融合酶组合质粒；

（3）取步骤（2）制得的pBbB5K-ydiI-MCAD- FadK- P450融合酶组合质粒转化到的大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；

所述诱导培养为将筛选培养的菌液降温至14～20℃适应0.5～2小时后，然后分别加入IPTG至浓度为0.32mM、加入癸烷至质量百分比浓度为2～5％、加入吐温80至质量百分比浓度为0.2～0.5％，继续诱导培养4～12小时，分离细胞，制得诱导细胞；

（4）将步骤（3）制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸至浓度为4～10g/L，在25～35℃条件下培养，制得10-羟基-2-癸烯酸；

所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油0.8～1.2％, 葡萄糖0.3～0.5％,抗生素40～60μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建含有重组质粒pBbB5K -P450融合酶，包括如下步骤：

以经过密码子优化的水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) P450NADH还原酶的融合酶基因为模板进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和P450NADH还原酶的融合酶基因分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K -P450融合酶；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1.45min，循环30次；72℃延伸5min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建含有重组质粒pBbB5K-FadK，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增脂酰CoA合成酶基因FadK, 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和脂酰CoA合成酶基因FadK分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K-FadK；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸5min。