[发明专利]一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法

说明书

本发明涉及一种利用大肠杆菌工程菌制备10‑羟基‑2‑癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建重组质粒pBbB5K‑P450融合酶、重组质粒pBbB5K‑FadK、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K‑YdiI；(2)构建pBbB5K‑ydiI‑MCAD‑FadK‑P450融合酶组合质粒；(3)融合酶组合质粒转化大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；(4)将诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸，培养，制得10‑羟基‑2‑癸烯酸。本发明以癸酸为原料发酵生产10‑羟基‑2‑癸烯酸，实现以低值癸酸生产高附加值10‑羟基‑2‑癸烯酸的过程。

技术领域

本发明涉及一种利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术

10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA)是一种含有羟基的单不饱和脂肪酸，分子式为C₁₀H₁₈O₃。迄今为止，自然界中仅从蜂王浆及蜂胶中发现，因此又称王浆酸。研究表明10-HDA具有抗菌、免疫调节及抗氧化，抗肿瘤，降低血糖等多种重要的生理功能，具有极高的医药和保健价值，应用前景十分广泛。该化合物结构如下：

鉴于10-HDA广泛而重要的应用价值，寻找10-HDA高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。10-HDA的结构式如下：

目前10-HDA的获得方法主要有物理提取法、化学合成法。其中物理提取法来源单一，蜂王浆中10-HDA含量仅为1.4％-2.4％，因此产量小，无法满足市场需求。而化学合成法虽然可以满足产业需求，但其操作步骤较冗繁，且化学试剂具有一定的毒性。因而探索10-HDA高效方便、低成本的合成方法，对其大规模开发和利用具有重要的理论和应用价值。近年来微生物发酵合成法生产10-HDA已经成为研究者及该行业的新目标。

但利用廉价的原料如癸酸发酵生产10-羟基-2-癸烯酸的相关技术未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌生产制备10-羟基-2-癸烯酸的方法。

本发明的技术方案如下：

一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：

(1)构建重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI；

所述P450融合酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；脂酰CoA合成酶基因FadK的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；脂酰CoA脱氢酶基因MCAD的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

(2)利用步骤(1)制得的重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI，构建pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒；

(3)取步骤(2)制得的pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒转化到的大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；

(4)将步骤(3)制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸至浓度为4～10g/L，在25～35℃条件下培养，制得10-羟基-2-癸烯酸；

所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：