[发明专利]鉴别人甲状腺结节良恶性的试剂盒及其使用方法和应用

说明书

本发明属于试剂盒技术领域，特别涉及鉴别人甲状腺结节良恶性的试剂盒及其使用方法和应用，所述试剂盒包括测序引物体系、PCR缓冲液体系、Taq酶、UNG酶以及阴性质控品；所述测序引物体系包括测定BRAF基因、KRAS基因、NRAS基因、HRAS基因及TERT基因上19个突变位点的引物对BRAF‑2、引物对KRAS‑2、引物对NRAS‑2、引物对HRAS‑3、引物对HRAS‑4和引物对TERT‑2。本发明的试剂盒能够同时检测多种基因变异，其检测结果可作为中间结果为临床诊断甲状腺结节良恶性、判断预后提供辅助，可进一步结合其他结果验证是否患有甲状腺癌，有效降低了错判、误判的概率。

技术领域

本发明属于试剂盒技术领域，特别涉及鉴别人甲状腺结节良恶性的试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

甲状腺结节(Thyroid nodule)是人群中普遍存在的一种甲状腺疾病，多数结节是良性的，可以采取保守治疗，但有5％-10％的甲状腺结节是恶性的，需要早期手术治疗，才能获得良好的预后。如果给予大量不需要手术的甲状腺良性结节患者手术治疗，将会产生巨大的医保负担；反之，如果不能从大量甲状腺良性结节中识别鉴定真正的恶性肿瘤，则延缓对这些患者的治疗，危及患者的生命健康。因此，及时准确的检测甲状腺结节的良恶性是至关重要的。

随着分子生物学技术的进展，分子诊断在甲状腺结节良恶性的鉴别诊断中，逐渐受到人们的关注。结节良恶性分子鉴别诊断的理论基础是基于有些甲状腺癌的致病基因，只在癌症患者的癌组织中发生特异性的体细胞突变或融合基因的出现，这种突变或新融合基因在患者的正常甲状腺细胞及非甲状腺癌患者的甲状腺组织中是不存在的。因此，以这些致病基因作为分子标志，在甲状腺癌的良恶性鉴别鉴别诊断中，具有特异性。

其中，BRAF基因上第600位氨基酸的Val600Glu突变的甲状腺结节100％的病人是恶性结节，虽然这些基因突变在甲状腺结节良恶性鉴别诊断中有非常好的特异性，但每一致病基因在甲状腺癌病人中的突变频率是不定的，因此，单靠这样对单个基因的分子突变进行检测，对阳性患者虽然有重要的鉴定意义，但对阴性患者存在漏诊的可能，耽误患者的治疗。因此要解决甲状腺癌分子诊断这一困境，需要对导致甲状腺癌的多个基因同时进行突变检测，才能够提高甲状腺结节良恶性鉴别诊断的特异性，降低假阴性率。

但是，想要在甲状腺结节样本中，同时进行多个甲状腺癌特异性致病基因的体细胞突变检测，需要突破以下几个方面的科学和技术难点：首先，虽然现有文献报道大量的甲状腺癌的致病基因突变，但在这些报道的突变基因中，哪些是真正的致病基因是不清楚的。其次，在目前报道的甲状腺癌致病基因中，哪些基因的组合在甲状腺结节鉴别诊断中阳性率高以及阴性漏诊可能性小也是不知道的。因此，找到这样的一群甲状腺癌致病基因的组合，将其应用于甲状腺结节良恶性鉴别中以降低错误、误判的概率，是非常重要的。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种鉴别人甲状腺结节良恶性的试剂盒，其基于甲状腺癌的致病基因只存在于癌症患者发生特异性体细胞突变的组织中这一特点，测定BRAF基因、KRAS基因、NRAS基因、HRAS基因及TERT基因上的突变位点，为鉴别甲状腺结节的良恶性提供了良好的辅助作用。

本发明的第二个目的在于提供一种鉴别人甲状腺结节良恶性的试剂盒的使用方法，其通过两轮PCR扩增，即便甲状腺结节的样本量较少，依旧能够正常扩增出目的基因。

本发明的第三个目的在于提供一种鉴别人甲状腺结节良恶性的试剂盒的应用，该试剂盒能够为临床诊断甲状腺结节的良恶性以及判断预后提供辅助作用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种鉴别人甲状腺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR缓冲液体系、测序引物体系、Taq酶、UNG酶以及阴性质控品；