[发明专利]中华鳖ZW性染色体型微创快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒

说明书

本发明公开中华鳖ZW性染色体型微创快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒。该引物组序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明可以微量(0.5‑1uL)中华鳖血液为起始模板，利用前述引物组进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现2031bp大小条带时，中华鳖为ZZ性染色体型；当扩增产物出现2031bp和1624bp大小的条带时，则中华鳖为ZW性染色体型。本发明以微创采集的微量血液为起始材料，快速检测中华鳖性染色体型，并且检测对受检个体损伤极小，可以确保各生长发育阶段的中华鳖取样后均可健康存活，为中华鳖单性养殖技术与性控育种中性染色体型鉴定提供重要工具。

技术领域

本发明属于分子生物学鉴定技术领域，涉及中华鳖ZZ/ZW性染色体型鉴定领域，特别涉及一种可以省去基因组提取操作的微创快速鉴定中华鳖性染色体型的PCR扩增引物组、位点、方法及试剂盒。

背景技术

中华鳖(Pelodiscus sinensis)隶属于爬行纲龟鳖目鳖科鳖属，俗称甲鱼、团鱼、王八等，其在我国分布于除新疆、西藏和青海以外的各个省份。目前，中华鳖养殖业已经发展成为了大规模、有影响的特种水产养殖产业，2017年中华鳖全国总产量达32.21万吨，居世界首位。

中华鳖作为我国重要的名贵水产品之一，其养殖生产性能存在显著的性别二态性，雄鳖生长速度较雌鳖快25％-30％。国内外市场对商品中华鳖存在性别偏好，国内市场偏爱雄鳖，雄鳖价格较雌鳖高20％左右；日本出口市场偏好雌鳖，通常要求商品鳖雌雄配比为4：1。因此，中华鳖产业对单性养殖和性控育种有强烈需求，但依靠现有的技术手段尚无法实现。首先，就单性养殖而言，核心问题在于如何在早期准确鉴定稚鳖性别。因为中华鳖养殖周期长，生态养殖情况下需要1冬龄才能通过外观进行鉴别。如可以在初孵稚鳖期就准确鉴定性别，即可在稚鳖期实现单性分塘养殖，可降低成本、提高效益。另外，采用性控育种技术实现中华鳖全雄育苗，需要采取伪雌亲本(即生理雌性，性染色体ZZ型)与雄性亲本(即生理雄性，性染色体型ZZ型)的技术路线，其核心技术之一就是如何鉴别性染色体型为ZZ的伪雌个体。尽可能越早、越准确地鉴别出伪雌个体，才可以使该技术路线具有实际可操作性。

目前，ZW性染色体型鉴别的方法有性染色体Z/W形态差异观察鉴定(王伟；钱国英；李彩燕等.2014)、性染色体Z/W基因组差异荧光原位杂交鉴定(Badenhorst,D；Stanyon,R；Engstrom,T et al.2013)。然而这些方法操作繁琐，且需牺牲待检个体或对待检个体造成严重创伤，因此不符合实际应用要求。

因此，开发出早期微创ZW性染色体鉴定技术，对中华鳖单性养殖技术和性控育种技术的实现，对中华鳖产业健康可持续发展具有重要推动作用。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的PCR引物组，且仅需一对引物即可实现ZW性染色体型区分鉴别。

本发明的第二个目的是提供一种快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的PCR方法，且该方法较常规PCR方法具有以下2个明显优点：一是该PCR方法无需上游基因组提取步骤，节省时间、试剂耗材成本；二是该PCR方法样本可以从初孵稚鳖至成鳖期采用无创或微创法获得。检测只需采集微量血液(微升级)即可满足检测样品需求，且省去基因组提取步骤，直接将微量全血(0.5-1μL)加入PCR体系即可。既节省基因组提取的时间、经济成本，又可将对待检中华鳖损伤降到最低，保证各生长发育阶段中华鳖性染色体型检测后的样本存活，创伤最低。

本发明的第三个目的是提供一种快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的试剂盒。

本发明的上述第四个目的是提供一种用于鉴定中华鳖ZW性染色体型的位点。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案实现：一种快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的PCR引物组，该引物组序列如下：

ZW性染色体型鉴别正向引物序列为：