[发明专利]一种提高腺相关病毒转染效率的方法

权利要求书

1.一种提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、细胞培养：将细胞复苏至T75方瓶中，使用含8％～10％牛血清及细胞贴附因子的营养液培养3代后，收获细胞状态较好的293T悬浮细胞，接种入10～20cm平皿进行培养，达到规定的细胞培养参数后，放入培养箱，设置好CO₂培养箱的培养参数，培养20-28h，细胞汇合率达到80％～90％，得含贴壁细胞的混合液；

S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入15～25mL含牛血清的DMEM培养液，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；

S3、293T细胞的孵育培养：将步骤S2所得转染混悬液放在含牛血清的营养液中孵育20～28h，然后取出放在CO₂培养箱中，设置好孵育的培养参数，培养20～28h，弃掉上清液，加入无血清DMEM培养液，设置孵育后的培养参数，进行孵育培养40-55h，得含腺相关病毒的混合液；

S4、转染后观察：将步骤S3所得含腺相关病毒的混合液于1000-1500r/min的速度下离心1～10min，收集细胞，在荧光显微镜下观察，同时使用流式细胞仪进行细胞转染率测定，即可；

所述步骤S1中的细胞贴附因子由E-钙粘蛋白，III型胶原及多聚赖氨酸按质量比3：7：4组成；所述步骤S2中含腺相关病毒的转染混合液中包含包装腺相关病毒的三种质粒，三种质粒分别为pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP，三种质粒的总质量为10～30μg，且三者的质量比为2：2：1。

2.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S1中的细胞培养参数为接种密度在0.8×10⁶～1.2×10⁶个/mL；所述CO₂培养箱的培养参数为温度35～38℃，CO₂浓度为3～7％。

3.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，步骤S2中所述含腺相关病毒的转染混合液中的血清类型可以为1~9型中的任意一种。

4.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S2含牛血清的DMEM培养基中牛血清的质量浓度为1％～50％。

5.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S2所述含腺相关病毒的转染混合液的制备方法为：将包装腺相关病毒的三种质粒、无菌水和CaCl₂溶液混合并定容到624μL，将等体积2×HBS盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀，并常温静止放置1～10min，即得。

6.如权利要求5所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述CaCl₂溶液为CaCl₂水溶液，且CaCl₂水溶液的浓度为2mol/L，加入量为10μL～100μL；所述2×HBS盐溶液的pH值为6 .0～7.5。

7.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S3中进行孵育培养时设置的孵育参数为温度30～37℃，CO₂浓度为3～7％。

8.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S3中孵育后的培养参数为温度36～38℃，CO₂浓度为5％。