[发明专利]一种提高腺相关病毒转染效率的方法

说明书

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种提高腺相关病毒转染效率的方法。本发明提供的提高腺相关病毒转染效率的方法，主要通过在细胞培养时，向营养液中添加细胞贴附因子，促进细胞贴壁，在转染过程中，选择pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP，三种质粒按质量比为2：2：1的比例加入到转染混合液中，极大的提高了转染效率。利用本发明提供的腺相关病毒转染方法，转染效率可以高达80％‑90％，提高了病毒转染的成功率，而且，该方法操作简单，大大节约了实验成本。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种提高腺腺相关病毒转染效率的方法。

背景技术

大约五十年前，科学家假设，外源DNA的遗传修饰可能对遗传性人类疾病的治疗有效。基因疗法通过将遗传物质导入细胞补偿或纠正异常基因，引入的正常基因拷贝能够帮助恢复必需蛋白质的功能。这种“基因治疗”策略为后续研究提供了理论基础，即通过一次治疗就可以获得持久且有效的临床治疗。这基因治疗种技术已从构想中来到了现实，那就是重组腺相关病毒(AAV)基因治疗技术，其具有安全性、有效性、特异性等多种优势，目前作为第一个已被欧盟批准的治疗脂肪酸酶缺陷的基因治疗药物Glybera上市了。

目前AAV生产主要的方法为三质粒转染293T细胞方法，其操作简单、快速，但AAV包装颗粒量低产，这大大限制了AAV规模化生产。因此，开发一种提高AAV产量的生产工艺技术，是目前取得大规模AAV生产技术关键之一。而现在病毒的转染效率太低，一般不高于50％，造成了对实验材料的大量浪费。

中国专利申请CN108893493A公开了一种提升NK细胞转染效率的方法。该方法是对NK细胞进行两次慢病毒感染，第一次感染时加入包含CAR的慢病毒载体的同时加入助感染剂1，第二次感染时加入包含CAR的慢病毒载体的同时加入助感染剂2、助感染剂3和助感染剂4；所述助感染剂1为含有聚凝胺溶液；所述助感染剂2为含有IL2的溶液；所述助感染剂3为含有IL12的溶液；所述助感染剂4为含有PHA的溶液。该方法虽然将转染率提升至50％-60％，但是，这个转染效率仍然较低，而且，仅适用于慢病毒，适用范围较窄。

综上可知，现有技术中病毒的转染方法中，普遍存在转染效率低，适用范围窄，浪费材料，成本高的缺点。

发明内容

针对现有技术中存在的缺点，本发明的目的是提供一种提高腺相关病毒转染效率的方法，该方法适用于腺相关病毒的9种血清型，适用范围广，而且转染效率可以达到80％以上，大大节约了成本。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种提高腺相关病毒转染效率的方法，包括如下步骤：

S1、细胞培养：将细胞复苏至T75放瓶中，使用含8％～10％牛血清及细胞贴附因子的营养液培养3代后，收获细胞状态较好的293T悬浮细胞，接种入10～20cm平皿进行培养，达到规定的细胞培养参数后，放入培养箱，设置好CO₂培养箱的培养参数，培养20-28h，细胞汇合率达到80％～90％，得含贴壁细胞的混合液；

S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入15～25mL含牛血清DMEM培养基，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；

S3、293T细胞的孵育培养：将步骤S2所得转染混悬液放在含牛血清的营养液中孵育20～28h，然后取出放在CO₂培养箱中，设置好孵育的培养参数，培养20～28h，弃掉上清液，加入无血清DMEM培养液，设置孵育后的培养参数，进行孵育培养40-55h，得含腺相关病毒的混合液；

S4、转染后观察：将步骤S3所得含腺相关病毒的混合液于1000-1500r/min的速度下离心1～10min，收集细胞，在荧光显微镜下观察，同时使用流式细胞仪进行细胞转染率测定，即可。