[发明专利]一种提高EGFP质粒转染效率的方法

权利要求书

1.一种提高EGFP质粒转染效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、细胞培养：将细胞复苏至T75放瓶中，使用含有0.8～2g的三抗及0.5～1.5g的杀菌剂的营养液，培养3代后，收获细胞状态较好的293T悬浮细胞，分别接种入3个摇瓶中进行培养，达到规定的细胞培养参数后，放入培养箱，设置好CO₂恒温振荡培养箱的培养参数，培养3代至细胞达到特定条件，得含悬浮细胞的混悬液；

S2、EGFP质粒转染293T悬浮细胞：将步骤S1所得含悬浮细胞的混悬液于1000～1500r/min的条件下离心1～10min，去除上清液，然后加入含EGFP质粒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；

S3、293T细胞的孵育培养：将步骤S2所得转染混悬液放入CO₂恒温振荡培养箱，设置好孵育培养参数，进行1～6h的静态或者动态孵育，孵育结束后加原体积一半的含有1％～20％牛血清及三抗的培养液进行培养，再设置好孵育后的培养参数，进行孵育后培养20～28h，得含EGFP质粒的混合液；

S4、转染后观察：将步骤S3所得含EGFP质粒的混合液于1000-1500r/min的速度下离心1～10min，弃掉全部上清液，加入不含血清的培养液，设置好换液后的培养参数，培养48～72h，取出细胞，在荧光显微镜下观察，即可；

所述步骤S1中的杀菌剂由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成；所述步骤S1、S3中的三抗由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成；

所述步骤S1中细胞培养参数为接种密度在1.0×10⁵～30.0×10⁵个/mL，细胞活率为90％～100％；所述CO₂恒温振荡培养箱的培养参数为温度35～38℃，转速30～100r/min，CO₂浓度为3～7％；所述特定条件为细胞密度达到1～9×10⁶个/ml，细胞活率稳定在90％～100％；

所述步骤S2中含EGFP质粒的转染混合液中EGFP质粒的量为100～1800μg。

2.如权利要求1所述的提高EGFP质粒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S2中含EGFP质粒的转染混合液的体积为10～90mL，pH值为6.0～7.4；所述含EGFP质粒的转染混合液中包含质量浓度为2.5mg/mL的聚醚酰亚胺溶液，且聚醚酰亚胺溶液的加入量为0.5～4.5mL。

3.如权利要求1所述的提高EGFP质粒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S3中的孵育培养参数为温度25～37℃，转速0～50r/min；所述孵育后的培养参数为温度35～38℃，转速50～100r/min，CO₂浓度3～7％。

4.如权利要求1所述的提高EGFP质粒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S4中换液后的培养参数为温度35～38℃，转速10～80r/min，CO₂浓度3～7％。