[发明专利]一种提高EGFP质粒转染效率的方法

说明书

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种提高EGFP质粒转染效率的方法。本发明提供的提高EGFP质粒转染效率的方法，主要是在细胞培养时，向营养液中加入由青霉素，四环素及氨基糖苷按质量比5：5：2组成的三抗，由乙基己基甘油和山梨酸醇按质量比7：4组成的杀菌剂，提高质粒的纯度，避免各种杂菌的污染，同时，在转染过程中加一个1‑6h的静态或动态孵育过程，提高了EGFP质粒的转染效率。本发明提供的提高EGFP质粒转染效率的方法，可以显著提高EGFP质粒的转染效率，使EGFP质粒的转染达到80％以上的转染率，而且，本发明提供的转染方法操作过程简单，极大地节约了实验成本。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种提高EGFP质粒转染效率的方法。

背景技术

悬浮细胞是指细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞等。在实验室经常会遇到悬浮细胞的转染，其和贴壁细胞转染还是有很大不同的。

目前大多数实验室用的是脂质体类的转染试剂，脂质体转染是基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。其次，脂质体试剂的毒性较大，这就使得悬浮细胞的转染更为困难了。另外，悬浮细胞不易培养，易死亡，也给细胞转染造成了一定的困难。

为了提高悬浮细胞的转染效率，可以使用非脂质体的转染试剂，如engreen的Entranster试剂，纳米材料的。也可以使用电转染方法，针对悬浮细胞等难转染细胞还是挺不错的，电击对细胞有一定的损伤，最好选用具有细胞膜修复功能的电转染试剂，可以将电击对细胞的伤害降到最低，如Entranster-E。因此，悬浮细胞不易转染，选对试剂及良好的细胞培养环境是提高质粒转染效率的关键。

中国专利申请CN106676133A公开了一种基于磷酸钙-PEG的质粒转染方法，这种方法主要包括配制PEG-DNA溶液，PEG-DNA氯化钙溶液配制，PEG-磷酸钙转染复合物的配制及细胞转染等过程。该方法使用PEG能够增强DNA-磷酸钙复合物形成的稳定性，提高了质粒转染效率，但是，这种方法需要先将细胞置于半悬浮状态，且会消耗大量的聚乙二醇溶液，而且，操作过程复杂，导致实验成本较高。

综上可知，现有技术普遍存在质粒转染效率低，操作过程复杂，成本高等缺点。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种提高EGFP质粒转染效率的方法，该方法可以将EGFP质粒的转染效率提升至80％以上，而且操作过程简单，成本低。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种提高EGFP质粒转染效率的方法，包括如下步骤：

S1、细胞培养：将细胞复苏至T75放瓶中，使用含有0.8～2g的三抗及0.5～1.5g的杀菌剂的营养液，培养3代后，收获细胞状态较好的293T悬浮细胞，分别接种入3个摇瓶中进行培养，达到规定的细胞培养参数后，放入培养箱，设置好CO₂恒温振荡培养箱的培养参数，培养3代至细胞达到特定条件，得含悬浮细胞的混悬液；

S2、EGFP质粒转染293T悬浮细胞：将步骤S1所得含悬浮细胞的混悬液于1000～1500r/min的条件下离心1～10min，去除上清液，然后加入含EGFP质粒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；

S3、293T细胞的孵育培养：将步骤S2所得转染混悬液放入CO₂恒温振荡培养箱，设置好孵育培养参数，进行1～6h的静态或者动态孵育，孵育结束后加原体积一半的含有1％～20％牛血清及三抗的培养液进行培养，再设置好孵育后的培养参数，进行孵育后培养20～28h，得含EGFP质粒的混合液；