[发明专利]小鼠巨噬细胞人补体膜攻击复合物体外模型及构建和应用

说明书

本发明属于免疫系统技术领域，具体涉及一种小鼠巨噬细胞人补体膜攻击复合物体外模型及构建方法和应用。本发明小鼠巨噬细胞人补体膜攻击复合物体外模型，通过以下步骤构建形成：(1)将1mL灭菌后的质量百分数为3％的硫乙醇酸盐培养基注入小鼠腹腔，两天后抽腹水，离心后去上清及红细胞，加DF12培养液重新制备成细胞悬液，再将细胞悬液滴入孔板或破片上，即为原代巨噬细胞；(2)根据不同的需求向原代巨噬细胞的培养液中添加C5b‑6、C7、C8和C9，孵育后形成小鼠巨噬细胞人补体体外模型，同时根据实验需要添加不同量的人补体成分C5b‑6、C7、C8和C9可以控制形成的MAC的量的多少，达到溶破杀伤细胞或者是调控细胞功能的效果。

技术领域

本发明属于免疫系统技术领域，具体涉及一种小鼠巨噬细胞人补体膜攻击复合物体外模型及构建方法和应用。

背景技术

补体系统是人免疫系统中的重要组成部分，其参与机体的特异性和非特异性免疫机制，表现为抗微生物防御反应，免疫调节及介导免疫病理的损伤性反应。补体系统是由30余种血清蛋白组成的具有级联酶促反应和自我调节机制的蛋白质反应系统,在激活物刺激下补体蛋白可通过经典或旁路途径被激活。补体的三种激活途径的共同末端途径中，补体成分C5b可与C6稳定结合为C5b6，后者自发与C7结合成C5b67，该复合物中的C7初步插入靶细胞膜脂质双分子层，继而C8与插入膜上的C5b67高亲和力结合，形成稳定的、深插入细胞膜的C5b678，接着该复合物可与12-18个C9分子结合为C5b6789n，此即膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC)，又被称为C5b-9。其结合到组织细胞上后可引起细胞活化、增殖、炎性介质的分泌、细胞趋化、细胞周期改变等一系列病理、生理变化过程。且一定条件下其可在细胞上形成小孔，使小的可溶性分子，离子及水分子自由透过细胞膜，但蛋白质等大分子难以逸出，导致水和离子内流，细胞内渗透压降低，细胞发生溶解。

MAC在人免疫系统中的功能十分重要，目前关于它的研究主要是聚焦其发挥作用的机制及在不同条件下其杀伤细胞的程度，这类研究中最基础的便是要构建膜攻击复合物模型，在此基础上才能开展后续研究。本专利就是提供了一种体外构建稳定的MAC模型的方法，这对于后续研究它的功能、机制都十分重要。

现有技术方案：迄今为止,已有内皮细胞、淋巴细胞、肾小球细胞等多种有核细胞MAC亚溶破模型的报道，但是多是在动物或人体组织中验证MAC的存在，而在体外构建出此模型的研究尚少。仅有的体外构建MAC的方法也都集中于用人或者动物的全血清来提供组装MAC的补体组份。而血清中的成分非常复杂，至今为止人们还没有明确血清中每一种物质的详细功能与含量。因为此实验中所需的补体成分非常容易失活，每次实验所用的血清都得现取现用，不能用商业化购买的血清。这个非标准化生产的过程使得每次实验中所用血清成分差异较大，这对于实验的定量分析是个问题，并且降低了实验的可重复性。故存在以下问题：1.补体反应可能由经典途径、旁路途径、MBL途径三种方法激活，他们的激活物分别是抗原抗体免疫复合物、细菌真菌病毒等，和病原微生物表面的甘露糖等等。血清中成分复杂，不能明确是哪一种途径激活了免疫反应，故每次试验的免疫反应的效应也不全一样。2.血清提供补体是没有经过剪切加工的补体，当血清从正常动物或人类身体中抽出时，可能因为之前没有激活物而不是有活性的补体成分，无法形成膜攻击复合物。3.每个个体血清中的补体含量不一样，每次抽取后还需定量分析，但是定量只能知道补体总量，不能明确每种补体含量，所以重复性不佳。特别是MAC的溶破效应强弱是与C5b678复合物所结合的C9分子的多少而决定的，一般可结合12-18个C9，成为C5b6789n。不知道每种补体的含量便无法控制实验所需条件。

发明内容

本发明主要针对背景技术中存在的问题，提供一种小鼠巨噬细胞人补体MAC体外模型及其制备方法和应用。

本发明为实现上述目的而采取的技术方案为：

一种小鼠巨噬细胞人补体膜攻击复合物体外模型，通过以下步骤构建形成：