[发明专利]一种检测3种寄生线虫的试剂盒及应用在审
| 申请号： | 201910096177.9 | 申请日： | 2019-01-18 |
| 公开（公告）号： | CN109609663A | 公开（公告）日： | 2019-04-12 |
| 发明（设计）人： | 杨怡;杜爱芳;卜丹茹;陈学秋;周静茹;孙洪超;郭筱璐 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人： | 赵杭丽 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 寄生线虫 试剂盒 检测 种检测 分子流行病学 寄生线虫感染 捻转血矛线虫 无菌去离子水 上样缓冲液 食道口线虫 工作效率 假阳性率 疗效监测 特异性强 准确检测 溴化乙锭 寄生虫 标准品 对照品 溴酚蓝 准确率 可用 省时 线虫 引物 省力 制备 应用 调查 | ||
1.一种检测3种寄生线虫的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应液，LA Taq DNA聚合酶、溴化乙锭DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品。其中，PCR反应液含有PCR缓冲液、dNTP Mixture、检测用引物，所述3种寄生线虫分别为捻转血矛线虫、食道口线虫、奥斯特线虫；
所述检测用引物分别为：
捻转血矛线虫上游引物Hc-its1-F：5’-CAACAGCTATGTTTTACGACTTTGT-3’
捻转血矛线虫下游引物Hc-its1-R：5’-CTTCAAGAAGTAATTTGGTTCGTAC-3’
食道口线虫上游引物Oes-its-F：5’-ACGCTGAGCTCTAGACTTAATGAGC-3’
食道口线虫下游引物Oes-its-R：5’-CATCTAGAACGAGGATCACACACAT-3’
奥斯特线虫上游引物Ost-its2-F：5’-AACTACTACAGTGTGGCTAGTTCAT-3’
奥斯特线虫下游引物Ost-its2-R：5’-GTCCCTATTTGAATCAATCTCATAT-3’。
2.根据权利要求1所述的一种检测3种寄生线虫的试剂盒，其特征在于，标准品为具有捻转血矛线虫、食道口线虫、奥斯特线虫的重组质粒：捻转血矛线虫标准品的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，食道口线虫标准品的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，奥斯特线虫标准品的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
3.根据权利要求1所述的一种检测3种寄生线虫的试剂盒，其特征在于，对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有有捻转血矛线虫、食道口线虫和奥斯特线虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无捻转血矛线虫、食道口线虫和奥斯特线虫DNA的DNA样品。
4.根据权利要求1所述的捻转血矛线虫、食道口线虫、奥斯特线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
5.根据权利要求1所述的试剂盒在检测3种寄生线虫中的应用，其特征在于，所述3种寄生线虫分别为捻转血矛线虫、食道口线虫、奥斯特线虫。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过以下技术方案实现：
(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物；
(2)PCR扩增：提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板，采用步骤(1)合成的引物进行PCR扩增反应；
(3)分析PCR扩增产物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增反应的反应体系为：ddH2O 12.2μl，10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP 2μl，6条引物中的Hc-its1-F、Hc-its1-R各1μl，Oes-its-F、Oes-its-R各0.5μl，Ost-its2-F、Ost-its2-R各1μl。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸28sec，30个循环；72℃延伸7min；保存于4℃。
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