[发明专利]一种检测3种寄生线虫的试剂盒及应用

说明书

一种检测3种寄生线虫的试剂盒，该试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应液，LA Taq DNA聚合酶、溴化乙锭DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品。其中，PCR反应液含有PCR缓冲液、dNTP Mixture、检测用引物，3种寄生线虫分别为捻转血矛线虫、食道口线虫、奥斯特线虫。是本发明即可快速、准确检测出3种寄生线虫DNA，也可用于3种寄生线虫感染的分子流行病学调查及疗效监测。本发明制备步骤简单费用低，仅一个PCR反应管中即可同时检测三种寄生虫的DNA，尤其是用于大量样品的大规模检测时，操作简单，不仅省时省力而且省钱，敏感性高、特异性强，检测准确率高，降低假阳性率，提高工作效率。

技术领域

本发明属于生物技术，涉及一种检测检测3种寄生线虫的试剂盒，尤其涉及一种检测捻转血矛线虫、食道口线虫、奥斯特线虫3种寄生线虫的试剂盒，可以同时对单个或多个混合感染捻转血矛线虫、食道口线虫、奥斯特线虫的标本进行鉴别检测。

背景技术

我国是牛羊饲养大国，由于牛羊等作为反刍动物的特殊生理特点及放养为主的饲养方式，寄生虫病成为危害牛羊最严重的疫病之一，每年造成巨额经济损失。再者，如羚羊、长颈鹿、牦牛等珍稀野生反刍动物寄生虫感染严重，健康和繁衍受到威胁。捻转血矛线虫是反刍动物常见的消化道寄生虫，寄生于真胃，以吸食宿主血液为生，会引起贫血、食欲不振、营养不良、腹泻便秘交替发作等症状，严重时可导致死亡，尤以羔羊为甚，死亡率可达30％以上。奥斯特线虫寄生于反刍动物的真胃，常与捻转血矛线虫混合感染，且一般情况下寄生数量较多，在幽门结成团块，会导致宿主严重腹泻、厌食、体重下降、低蛋白血症，生产力下降等。食道口线虫寄生于反刍动物的大肠，在牛羊中普遍存在，会引起肠的结节病变，引发肠炎甚至腹膜炎，使病畜消瘦、下痢、恶病质，最终可因机体衰竭而死亡。要控制这些反刍动物寄生虫病的流行，首先必须做到精确诊断。

这三种寄生虫是目前我国牛羊等反刍动物感染率最高的消化道寄生性线虫，且常呈混合感染。传统的诊断方法依靠显微镜镜检粪便虫卵，但圆线虫虫卵形态相似难以辨认，给准确诊断带来了较大的困难。因此，建立一个简单、快速、灵敏、特异的检测方法迫在眉睫。PCR方法是一种操作简单、敏感性高、特异性强的分子生物学检测方法，多重PCR方法除具有普通PCR的优点之外，还可以在一个反应体系中同时扩增两份或者多份DNA样本的不同目的基因片段，特别适合用于混合感染的大量临床样本的快速诊断。因此建立这三种消化道寄生线虫的多重PCR检测方法可以为临床上这三种病的防治提供科学依据，是反刍动物寄生虫病防治和畜牧业发展的需要，具有较好的临床应用价值和经济价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测3种寄生线虫的试剂盒，所述3种寄生线虫分别为捻转血矛线虫、食道口线虫、奥斯特线虫，所述试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应液、LA TaqDNA聚合酶、溴化乙锭DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品。

其中，PCR反应液含有PCR缓冲液、dNTP Mixture、检测用引物。

所述检测用引物分别为检测3种寄生虫的上游引物和下游引物共6条：

标准品为具有捻转血矛线虫、食道口线虫、奥斯特线虫的重组质粒：捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)标准品的核苷酸序列如SEQ ID No.7，食道口线虫(Oesophagostomum radiatum)标准品的核苷酸序列如SEQ ID No.8，奥斯特线虫(Osteragia ostertagi)标准品的核苷酸序列如SEQ ID No.9，具体序列见序列表。

对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有捻转血矛线虫、食道口线虫和奥斯特线虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无捻转血矛线虫、食道口线虫和奥斯特线虫DNA的DNA样品。

本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。