[发明专利]一种间充质干细胞的超低温冻存与复苏方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞冻存液，其特征在于，由以下体积比的各组分组成：3-10％血清替代物，8-10％DMSO，5-25％人血白蛋白，以及55-84％α-MEM基础培养基。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，由以下体积比的各组分组成：10％GMP级血清替代物如Helios或PALL牌产品，10％DMSO，10％人血白蛋白，以及70％α-MEM基础培养基如Corning、Hyclone或BI牌产品。

3.如权利要求1或2所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，其中所述间充质干细胞为从人源脐带组织获取的间充质干细胞。

4.使用权利要求1-3的冻存液对间充质干细胞进行超低温冻存与复苏的方法，其包括以下步骤：

1)从原代间充质干细胞扩增的干细胞经消化后，用由基础培养基和血清替代物组成的完全培养基重悬，其中所述完全培养基中含有3-5％体积比的血清替代物，然后分别用权利要求1-3的冻存液调整细胞悬液中的细胞密度，然后将细胞悬液分装于冻存管中，贴好标签用封口膜或医用胶带封口；

2)迅速将上述冻存管放于程序降温盒中；

3)再将所述程序降温盒迅速放入-80℃冰箱中过夜；

4)将所述间充质干细胞迅速由冰箱转移至液氮罐中进行冻存；

5)将上述液氮罐中冻存了一定时间的间充质干细胞冻存管取出，快速放入37-40℃水浴锅中，迅速摇晃冻存管，使其受热均匀，注意水面不得没过冻存管瓶盖；

6)当冻存管中的间充质干细胞融化后，迅速将所述冻存管中的干细胞转移至生理盐水中，1000-1500rpm离心3-5min，弃上清，使用生理盐水洗涤，用新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，取样测定细胞的总数和复苏活率；

7)调整上述细胞悬液中的间充质干细胞如P2代的密度，然后接种于细胞培养瓶中；

8)将所述培养瓶置于细胞培养箱中继续培养，并观察新一代间充质干细胞生长情况，如由P2代复苏培养后的干细胞即P3代，取样测定间充质干细胞的总数，计算细胞活率。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述基础培养基为α-MEM基础培养基如Corning、Hyclone或BI牌产品，且所述血清替代物为GMP级血清替代物如Helios或PALL牌产品，并调整细胞悬液的细胞密度为6×10⁶/mL-7×10⁶/mL，然后按1mL/管将细胞悬液分装于冻存管中。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述程序降温盒为美国BIOCISION公司的程序降温盒。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述液氮罐为气相液氮罐。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤6)中当冻存管中的间充质干细胞融化后，迅速将所述冻存管中的干细胞转移至50mL生理盐水中，1200rpm离心3min，弃上清，使用生理盐水洗2次。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤7)中以5000-6000个/cm²的起始接种密度将所述细胞悬液中的间充质干细胞接种于T-175细胞培养瓶中，总体积为25mL/瓶。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤8)中将所述培养瓶置于细胞培养箱中，于37℃、5％CO₂下继续培养3-4天。