[发明专利]一种间充质干细胞的超低温冻存与复苏方法

说明书

本发明提供了一种无血清间充质干细胞冻存液，以及使用该冻存液对间充质干细胞进行超低温冻存与复苏的方法。相比现有技术中含有胎牛血清的冻存液及使用其的冻存复苏方法，使用本发明的无血清冻存液对间充质干细胞进行冻存，冻存过程没有加入胎牛血清，这避免了引入异种来源蛋白可能带来的风险；采用封口操作、程序降温盒，以及通过气相液氮罐存储细胞，在确保冻存效果的同时有效降低冻存过程中液氮的进入，从而降低冻存过程中污染和复苏时炸管的风险，最终间充质干细胞复苏后的活率达到90％以上，能够满足间充质干细胞临床应用的需要。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的超低温冻存与复苏方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是一类来源于发育早期中胚层及外胚层的多能干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。间充质干细胞在临床上可应用于解决多种血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病等，此外还在神经系统修复等方面具有发展前景。

间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞，但存在以下问题：随着年龄的老化，骨髓间充质干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；其制备过程不容易质控；移植给异体时可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。

研究表明，脐带来源的间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志物，并具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低的特性；另外其取材方便，无道德伦理问题的限制，更易于工业化制备。因此，脐带间充质干细胞不仅能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。

通常干细胞冻存时的冻存液需要使用胎牛血清(FBS)，否则细胞复苏活率较低；虽然FBS可为间充质干细胞提供必要的营养物质，但FBS属于动物源性物质，成分比较复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了细胞污染的几率。另外，冻存细胞的存储采用普通液氮罐居多，由于冻存管长期浸于液氮中，难免会有液氮进入到冻存管中，这样一方面增加了冻存细胞被污染的风险，另一方面在复苏细胞时也存在因操作不慎而炸管的风险。

综上所述，如何有效地提高冻存细胞的复苏率和培养扩增后的细胞活率，是目前本领域技术人员急需解决的问题。

发明内容

为了克服以上细胞冻存和复苏的现有技术中存在的缺点，本发明一个目的在于提供一种间充质干细胞冻存液，其由以下体积比的各组分组成：3-10％GMP级血清替代物，8-10％DMSO，5-25％人血白蛋白，以及55-84％α-MEM基础培养基。

在本发明上述冻存液的一些实施方案中，所述间充质干细胞冻存液由以下体积比的各组分组成：10％GMP级血清替代物如Helios或PALL牌的产品，10％DMSO，10％人血白蛋白，以及70％α-MEM基础培养基如Corning、Hyclone或BI牌的产品。

在本发明上述冻存液的一些实施方案中，所述间充质干细胞为从人源脐带组织获取的间充质干细胞。

本发明另一个目的在于还提供一种使用上述冻存液对间充质干细胞进行超低温冻存与复苏的方法，其包括以下步骤：

1)从原代间充质干细胞扩增的干细胞经消化后，用由基础培养基和血清替代物组成的完全培养基重悬，其中所述完全培养基中含有3-5％体积比的血清替代物，然后分别用权利要求1-3的冻存液调整细胞悬液中的细胞密度，然后将细胞悬液分装于冻存管中，贴好标签，用医用胶带封口；

2)迅速将上述冻存管放于程序降温盒中；

3)再将所述程序降温盒迅速放入-80℃冰箱中过夜；

4)将所述间充质干细胞迅速由冰箱转移至液氮罐中进行冻存；