[发明专利]硝化菌属细菌的检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供硝化菌属细菌的检测方法及试剂盒，属于细菌检测领域，其检测试剂盒，包含序列如SEQ ID NO:1～3所示的探针1～3，其中，探针1用FAM标记，探针2用HEX标记；探针2和3同时使用；硝化菌属细菌的检测方法包括：玻片预处理；样品预处理；杂交反应和检测；其中，处理玻片用明胶粘附剂的配置方法为：将明胶溶于重蒸水中，加热搅拌，加入明矾，再依次加入芦丁和7‑羟基黄酮醇，溶解后稀释。本发明提供的试剂盒和方法可检测硝化菌属细菌，特异性强、耗时短，用于快速检测污泥中硝化细菌，为研究硝化细菌类群的空间和数量分布提供了有效的工具。

技术领域

本发明属于细菌检测领域，具体涉及硝化菌属细菌的检测方法及试剂盒。

背景技术

作为硝化细菌，已知将氨氧化成亚硝酸的氨氧化细菌(亚硝酸菌)及将亚硝酸氧化成硝酸的亚硝酸氧化细菌(硝酸菌)。这些硝化细菌承担着自然界中的氮循环反应。另一方面，在产业上硝化细菌例如在以活性污泥法为代表的废水的生物处理工艺中的氮除去中承担着重要的作用，与防止因氮盐的流出所导致的自然水域的富营养化有关。

废水处理所用的活性污泥中含有各种微生物，其中，硝化菌属细菌是在氮除去中起到重要作用的亚硝酸氧化细菌中的一种。此时，期待根据废水中的氮量及废水处理所要求的处理速度，对活性污泥中的硝化菌属细菌的量进行监测、调节。因此，从存在多种微生物种的活性污泥中仅对硝化菌属细菌迅速地进行检测及定量成为课题。

荧光原位杂交是直接法杂交的一种,其原理是dsDNA的变性和与带有互补顺序的同源单链退火配对形成双链结构的过程。退火复性形成的可以是双链DNA或DNA/RNA异质双链分子。带有荧光标记的探针与固定在玻片或纤维膜上组织或细胞中特定的核昔酸序列进行杂交,而无需单独分离出DNA或RNA,探测其中所具有的同源核酸序列,结果可直接在荧光显微镜下观察。特异性和灵敏度极高,探测的灵敏度可达到10-20个mRNA拷贝/细胞。在分析环境样品中对硝化细菌的研究具有传统方法不可比拟的优势,它快速便捷,不仅可以定性,而且可以对环境中的硝化细菌进行直接计数,为研究硝化系统中硝化细菌类群的空间和数量分布提供了有效的检测工具。

CN 108291263 A的中国发明专利，公开了硝化菌(Nitrobacter)属细菌的检测方法，包括以下工序：第一工序，以待检DNA为模板，使用能够对序列号1所记载的碱基序列中的连续的110个碱基以上且157个碱基以下的碱基序列进行扩增的引物，使核苷酸扩增，获得扩增产物；和第二工序，对扩增产物进行检测；使用该发明进行硝化细菌检测，工序较复杂，耗时长。

发明内容

本发明的目的在于提供硝化菌属细菌的检测方法及试剂盒，该检测方法快速便捷，耗时短，特异性强，可原位检测出硝化细菌的分布情况，结合稀释的方法，可对环境样品中的硝化细菌进行定量分析；为研究硝化细菌类群的空间和数量分布提供了有效的工具。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

本发明硝化菌属细菌的检测试剂盒，包含序列如SEQ ID NO:1～3所示的探针1～3；探针1用FAM标记，探针2用HEX标记；探针2和3同时使用。

本发明硝化菌属细菌的检测方法，包括如下步骤：

a,玻片预处理；

b,样品预处理；

c,杂交反应；

d,检测。

其中，样品为活性污泥。

作为优选，玻片预处理的方法为：将玻片依次进行一般处理、硅化处理后，用明胶包埋，明胶的温度保持在55-65℃。