[发明专利]一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1

权利要求书

1.一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，其特征在于：一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人NM号为134442.4的CREB1基因()的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段：GCCGGGTACTACCATTCTACA；分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN-1；在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成，用T₄DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒，构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体，待细胞生长至汇合度为60％左右时开始转染A549/DDP细胞，通过qRT-PCR检测RNAi后的CREB1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测RNAi后的CREB1和MRP1蛋白表达水平，使用Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化并分析结果；流式细胞术检测细胞Rho123外排，结果显示，敲低CREB1的表达能下调MRP1基因的表达，且肺癌A549/DDP细胞Rho123外排减弱，药物潴留量增加，逆转肺癌细胞MDR。

2.根据权利要求1所述的一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，其特征在于：所述的复苏和培养A549/DDP细胞的步骤为：细胞复苏：液氮中取出冻存细胞，在37℃水浴锅内摇晃，至其全部融化；缓慢滴入含5mL 1640培养基的离心管中，1000g离心5min，弃上清；用5mL 1640完全培养基悬浮细胞沉淀，移至细胞瓶，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞；细胞传代：弃原瓶内培养基，用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍；加入1mL0.25％胰酶消化细胞，镜下观察，待60％的贴壁细胞皱缩成亮点形态，加入完全培养基终止消化并反复吹打使其从壁上脱落；向细胞悬液中加入10mL完全培养基吹匀后，分别取出5mL加入两个新瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞；A549/DDP细胞复苏和培养结果：细胞为贴壁生长，A549/DDP呈多边形，细胞生长状态良好。

3.根据权利要求1所述的一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，其特征在于：所述的构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体的步骤为：设计shCREB1：根据NCBI中人CREB1基因的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段：GCCGGGTACTACCATTCTACA；分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN-1；在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成的序列；用HindⅢ、BamHⅠ双酶切pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体，琼脂糖凝胶电泳检测载体是否切开，使用T₄DNA连接酶，按照连接体系进行连接；双酶切回收后的线性与退火后的shCREB1片段的摩尔比为1：5，按照表5体系进行连接；合成上下游序列退火反应，反应体系为：上游引物，2μL；下游引物，2μL；10×PCR buffer，5μL；dd H2O，41uL；用T₄DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接体系为：PCR产物，1.0μL；10×buffer，1.0μL；回收的双切载体，2.0μL；dd H2O，5.0μL；T4DNA连接酶，1.0μL；连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒；双酶切验证及送至上海生工生物技术服务有限公司测序鉴定测序验证。