[发明专利]一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1

说明书

一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN‑1，属于基因工程技术领域，其特征在于：设计最优靶向CREB1的干扰片段，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体，命名为pFYJN‑1，转染肺癌细胞，通过qRT‑PCR、Western blot和Odyssey双红外激光成像系统检测RNAi后的CREB1和MRP1基因mRNA、蛋白的表达水平和蛋白条带变化并分析结果；流式细胞术检测细胞Rho123外排，结果显示：敲低CREB1的表达能下调MRP1基因的表达，且肺癌细胞Rho123外排减弱，药物潴留量增加，逆转肺癌细胞MDR。

技术领域

本发明涉及一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，属于基因工程技术领域。

背景技术

多药耐药(muhidrug resistance,MDR)是指肿瘤细胞长期通过某一化疗药物治疗，对此药物产生耐药现象,而且不仅对此种化疗药物产生耐药性，对其他结构和功能不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药现象，这是造成化疗失败的主要原因(Ullah et al.,2014)。因此，探索MDR机制是解决耐药问题、改善化疗效果的关键。相关研究表明，MDR通过几种机制发生，其中MDR的经典细胞机制涉及通过各种膜转运蛋白流出药物。ATP结合盒(ABC)转运蛋白是一类蛋白质，通过ATP依赖性药物外排泵介导MDR。已经表征了ABC超家族的几种转运蛋白，包括P-糖蛋白(P-gp，MDR-1；ABCB-1)，多药耐药相关蛋白-1(MRP-1；ABCC-1)，(BCRP；ABCG-2)在化学抗性细胞中过表达(Kim et al.,2015)。MDR的主要机制是由于MDR相关蛋白(例如多药耐药相关蛋白1(MRP1))通过质膜从治疗的癌细胞中主动流出多种抗癌药物(Luet al.,2015)。cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)，是核转录因子。该基因的交替剪接导致编码不同种型的几种转录物变体；作为转录激活因子，CREB1与启动子上的保守cAMP反应元件(CRE)结合，并介导对多种刺激的转录反应，包括激素，膜去极化，生长和神经营养因子，从而充当不同信号通路之间的介质(Xie etal.,2015)。近期研究发现，CREB蛋白水平在部分癌组织和细胞中呈高表达(Tan et al.,2012)，如果阻断CREB与细胞增殖相关基因的结合能显著性抑制肿瘤细胞的生长。由此可见，CREB作为在多种肿瘤中高表达并发挥重要作用的转录因子，参与到肿瘤细胞的增殖、存活及转移等各个方面的调节。因此如何发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1成为急需解决的一大难题，所以首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人CREB1基因(NM号：134442.4)的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段：GCCGGGTACTACCATTCTACA。分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN-1。在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成，用T₄DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒，构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体，利用shRNA干扰表达载体转染A549/DDP细胞，通过qRT-PCR检测RNAi后的CREB1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测RNAi后的CREB1和MRP1蛋白表达水平，发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1是必要的。

发明内容