[发明专利]构建一株表达副猪嗜血杆菌Omp26基因的猪霍乱减毒沙门菌重组菌株

说明书

本发明涉及构建一株表达副猪嗜血杆菌Omp26基因的猪霍乱减毒沙门菌重组菌株，通过选择Omp 26为外源基因，无抗性质粒pYA3493为载体，猪霍乱减毒沙门氏菌C500 asd基因缺失株为受体菌，构成Asd+平衡表达系统，其在无外源选择压力的条件下能稳定遗传asd基因，能克服以往外源基因不稳定遗传的问题，且该系统无任何抗生素基因的标记，不会产生生物安全问题，这为将其开发成安全高效的疫苗活载体奠定了基础；同时又能良好表达副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白Omp 26，其亦可作为研究副猪嗜血杆菌临床检测、流行病学调查和免疫检测的一个特殊蛋白，为后续猪霍乱‑副猪嗜血杆菌二联疫苗研究提供基础设想。

技术领域

本发明涉及动物细菌性疾病基因工程疫苗技术领域，具体涉及构建一株表达副猪嗜血杆菌Omp26基因的猪霍乱减毒沙门菌重组菌株。

背景技术

沙门氏菌为胞内寄生菌，疫苗株能有效呈递抗原，在激发抗沙门氏菌免疫反应的同时诱导产生针对外源抗原的特异性体液和细胞免疫反应，沙门氏菌载体本身具有免疫佐剂作用，其脂多糖(LPS)作为一种内在佐剂可以刺激宿主细胞释放各种细胞因子。鉴于此，以营养缺陷型(Asd基因)减毒沙门氏菌作为粘膜免疫用基因工程活疫苗表达载体具有无可比拟的优越性。基于减毒胞内菌在运送疫苗的过程中能将其直接运送至专业抗原提呈细胞(APC)内，大大提高了疫苗的摄入效率，并能刺激机体产生体液免疫、细胞免疫以及黏膜免疫应答。此外减毒胞内菌的宿主载体平衡致死系统解决了外源基因在动物体内无抗性稳定表达的难题。

猪霍乱沙门菌C500株是将抗原性良好的猪霍乱沙门菌强毒株通过醋酸陀体外传代培养的方式筛选出来的1株其毒力弱、遗传稳定、免疫原性好、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株。

C500Δasd以C500为亲本株，在基因组上缺失asd基因，构建了平衡致死系统，用于高效表达外源基因；pYA3493(即外源基因表达质粒，质粒图谱如图1所示)，含有来源于鼠伤寒沙门菌的asd基因，与C500的asd基因100％同源。Asd+平衡表达系统由沙门氏菌的asd基因缺失株C500Δasd与含有asd基因的pYA3493质粒构成。只有含Asd+质粒的沙门氏菌asd缺失株才能在无DAP存在的条件下存活，并在体内或体外高效稳定表达外源基因。图2是C500在普通麦康凯平板上的生长效果图，其显示为可生长；图3为C500Δasd在普通麦康凯平板上的生长效果图，其显示为不能生长；图4为C500Δasd在添加了DAP的麦康凯平板上的生长效果图，其显示为长出细小无色透明、光滑、圆整的菌落；图5为Asd+平衡表达系统在无DAP的麦康凯平板上的生长效果图，其显示为可生长。

Asd+平衡表达系统质粒中含有asd基因，可与asd基因缺失的猪霍乱减毒沙门菌C500株载体形成互补，由于asd基因是DAP(是所有革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分)生物合成途径中必需的酶，该基因的缺失可导致该突变株在无外源DAP存在的条件下溶菌死亡。只有含有asd+质粒的细菌才能在无外源DAP的宿主内存活，因此，其稳定性大大提高，在含有asd基因的pYA3493质粒上插入副猪嗜血杆菌外膜蛋白Omp 26外源基因，将此种质粒转化至asd基因缺失的猪霍乱减毒沙门菌C500株，免疫动物后，能产生特异性的免疫保护应答，从而达到了无需抗性标记高效稳定运送副猪嗜血杆菌外膜蛋白Omp 26外源基因的目的。

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪的条件性致病菌，常引起以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等为特征的格拉瑟氏病，危害养殖业的发展，并已证实在我国绝大多数猪场存在和流行，在全球范围内影响养猪业典型的细菌性疾病，危害日渐严重。虽然抗生素治疗具有一定效果，但长期使用可导致细菌产生耐药性并存在药物在动物食品中的残留问题。因此，研制安全、高效、制备方便和廉价的新型基因工程疫苗成为越来越多研究者关注的焦点。

目前预防HPS病的疫苗为灭活疫苗，但是副猪嗜血杆菌的血清型多样，且很大比例不能分型，菌株间的毒力差异较大，至今还没有一种灭活疫苗诱导的免疫