[发明专利]一种DC-CTL细胞的诱导活化试剂盒及其应用方法

权利要求书

1.一种DC-CTL细胞的诱导活化试剂盒，包括带盒盖和盒体，其特征在于：所述盒体内部设有一个海绵托，该海绵拖上设有六个固定孔，该六个固定孔内分别放置有内容调制CTL细胞因子激活液IL-2的试剂瓶，内容调制CTL细胞因子激活液IFN-γ的试剂瓶，内容调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液的试剂瓶，内容调制DC细胞因子激活液TNF-α的试剂瓶，内容淋巴细胞分离液的试剂瓶，以及内容无血清培养液的试剂瓶。

2.根据权利要求1所述的DC-CTL细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于：IL-2的浓度为300-1200IU/ml，IFN-γ浓度为400-1600U/ml，IL-4和GM-CSF混合液中IL-4的浓度为50-300ng/ml以及GM-CSF浓度为600-1500U/ml，TNF-α的浓度为300-1200U/ml。

3.根据权利要求2所述的DC-CTL细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于：IL-4和GM-CSF混合液中IL-4的浓度为100ng/ml以及GM-CSF浓度为1000U/mlU/ml。

4.根据权利要求2所述的DC-CTL细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于：TNF-α的浓度为500U/ml。

5.根据权利要求2所述的DC-CTL细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于：IFN-γ浓度为1000U/ml。

6.根据权利要求2所述的DC-CTL细胞的诱导活化试剂盒，其特征在于：IL-2的浓度为500IU/ml。

7.一种DC-CTL细胞的诱导活化试剂盒的应用方法，用于DC-CTL细胞的诱导活化试剂盒，该试剂盒包括调制CTL细胞因子激活液IL-2，调制CTL细胞因子激活液IFN-γ，调制DC细胞因子激活液IL-4和GM-CSF混合液，调制DC细胞因子激活液TNF-α，淋巴细胞分离液，以及无血清培养液，其特征在于，包括如下步骤：

单采机采集外周血单个核细胞1×10⁹-3×10⁹；

血液预处理:将所采集50ml外周血单个核细胞，置于1支50ml的离心管(A管)中,离心A管(400-1200g,8-30min),上清转移至50ml离心管待处理备用，A管下部的细胞作ficoll分离PBMC(外周血单核细胞)用；

细胞的分离：血液预处理获得的A管下层细胞用生理盐水1:1稀释，混匀，将40ml淋巴细胞分离液ficoll等量均分放入2支50ml刻度离心管(D管和E管)。将A管中已稀释的细胞悬液等量均分沿管壁缓慢匀速加入D管和E管。滴加过程中注意用力均匀，避免破坏ficoll-白细胞界面的完整性，离心D管和E管(300-1200g,10-35min，离心机升降速调到最慢)，离心后，管内液体分为三层，移液管弃去上层约15ml液体后吸取上、中层界面处白色云雾层狭窄带(即所需PBMC，约5ml)放入H管，生理盐水洗2次(600g,8min)后弃上清，每管40ml无血清细胞培养液重悬细胞分离所获得的PBMC；

接种细胞：将200ml-600ml PBMC细胞悬液分别加入细胞培养瓶T175cm²，置饱和湿度、37℃、3.0％-10.0％CO₂培养，2小时后，将细胞培养瓶中悬液的取出，磁珠分选获得CD8⁺T淋巴细胞，冻存为T细胞；其中的贴壁细胞加入50ml/瓶培养液以及50ul DC细胞诱导因子50-300ng/ml IL-4和600-1500U/ml GM-CSF混合液，用于DC细胞诱导培养；

培养至第4天，向DC细胞培养瓶中加入10ul DC细胞诱导因子50-300ng/ml IL-4和600-1500U/ml GM-CSF混合液；

培养至第6天，加入肿瘤抗原5ul；

培养至第7天，加入10ul DC细胞诱导因子TNF-α(300-1200U/ml)；

第8天，复苏T细胞，将成熟的DC细胞平均分成3份，2份用于冻存，1份与复苏的T细胞共培养，加入活化液300-1200IU/ml IL2、400-1600U/ml IFN-γ诱导肿瘤抗原特异性DC-CTL，并取样进行DC标记检测；

第9天，复苏1份DC细胞加入DC-CTL，同时加入活化液300-1200IU/ml IL2、400-1600U/ml IFN-γ对DC-CTL进行培养；

第10天，复苏1份DC细胞加入DC-CTL，同时加入活化液300-1200IU/ml IL2、400-1600U/ml IFN-γ对DC-CTL进行培养；

第11天，将DC-CTL加入已包被细胞培养瓶，对DC-CTL进行扩增；

第13天，加入活化液300-1200IU/ml IL2、400-1600U/ml IFN-γ及细胞培养液对DC-CTL进行培养；

第14天，详细观察细胞生长状态后，随机均匀抽样5ml，台盼蓝染色法计数活细胞、死细胞总数量，同时取样做淋巴细胞表面标记检测；并确认细胞悬液细菌、真菌涂片、支原体及内毒素检测为阴性后，回输DC-CTL及DC，收集细胞约4000ml，离心(1500rpm，8min)，洗液(含有0.2％人白蛋白的注射用生理盐水)洗涤(1500rpm，8min)2次，洗液按照500ml生理盐水、50万IU的IL-2、5ml 20％人血清白蛋白的配比，重悬细胞，将其装入细胞回输袋用热合机将管口热合封闭，并留样封存。