[发明专利]一种快速的基于Ct值的从多种近似种中鉴别褐飞虱的引物、试剂盒及方法

说明书

一种用于鉴定褐飞虱的特异性引物对、质控重组质粒、试剂盒及其检测方法，属于害虫预测预报技术领域。本发明公开了一种用于鉴别褐飞虱的引物对Nl‑Its1‑F1/Nl‑Its1‑R1；还公开了用于鉴定褐飞虱的试剂盒及其检测方法，试剂盒包括2×Reaction Buffer Mix，上述引物对和一个质控重组质粒P；该方法是以粗组织液为定量扩增模板，通过比较样本与质控质粒Ct值的大小，即可判断是否为褐飞虱。上述一种用于鉴定褐飞虱的特异性引物对、质控重组质粒、试剂盒及其检测方法，可直接用于基层植保站对褐飞虱的快速鉴定，对节省人力物力和提高水稻重大害虫褐飞虱的预测预报准确度具有极为重要的意义。

技术领域

本发明属于害虫预测预报技术领域，具体为一种快速的基于Ct值的从多种近似种中鉴别褐飞虱的引物、试剂盒及方法。

背景技术

水稻（Oryza sativa L.）是中国乃至全球最重要的粮食作物之一，其产量和品质直接关系到世界人民的温饱问题和幸福满意度。在中国，水稻的产量则直接关系到我国的粮食安全。但水稻受病虫草为害严重，虽经防治仍然造成可观的经济损失。褐飞虱[Nilaparvata lugens (Stål)]是亚洲稻区最严重的水稻害虫之一，具远距离迁飞习性。准确的虫情预测预报是害虫防治的关键，目前主要采用灯诱监测。测报灯下褐飞虱的始见日、迁入量、迁入峰是褐飞虱预测预报的重要依据，也是褐飞虱防治策略制定的关键信息依据。

拟褐飞虱[Nilaparvata bakeri (Muir)]和伪褐飞虱[Nilaparvata muiriChina]是褐飞虱的同属近似种，并不以水稻为适宜寄主。但它们与褐飞虱具有广泛的共同分布区域，发生季节也有交叉，且都具有趋光性，对预测预报的准确性造成了严重影响。褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱形态非常相似，肉眼难以区分。传统的形态学鉴定方法，耗时费力，需专业人员借助于显微镜才能区分。然而，即使是专业人员，有时对有损标本和若虫也无能为力。崔亚丽等（2012年）以纯DNA为模板，初步建立了褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱的多重PCR检测技术，但具有耗时长，费用高等缺点；刘淑华等（2018年）以粗组织液为模板，建立了三种飞虱的直接多重PCR检测技术，但需要凝胶电泳检测环节，也具有耗时长、人为出错率高的不足。因此，植保人员急需一种简便，快速，易操作的鉴定方法。

荧光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程。Ct值(Cycle threshold，循环阈值)是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。Ct值与初始模板量存在一定负相关性，可用于初始模板量的计算。目前，荧光定量技术已被广泛用于医学与检疫领域的物种鉴定，但对于褐飞虱及其近似种的鉴别，还没有相关人员尝试。另外，目前结合荧光定量PCR技术进行微生物和检疫物种鉴定的方法或是以纯DNA为模板，或是以探针法进行的，亦具有耗时长，耗费高的缺点。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种快速的基于Ct值的从多种近似种中鉴别褐飞虱的引物、试剂盒及方法的技术方案，该方法通过比较样本与质控质粒Ct值的大小，即可判断是否为褐飞虱。本发明不需DNA提取，用水研磨的粗组织液即可作为模板；本发明由于包含了质控质粒，是用定量的思路方法进行定性，对试剂及耗材的质量要求不高；本发明只需两个温度，30循环即可，1小时内便可得到结果。该特异性引物和试剂盒及建立的检测方法具有灵敏、快速、高通量和简单易操作等优点，可直接用于基层植保站对褐飞虱的快速鉴定，对节省人力物力和提高水稻重大害虫褐飞虱的预测预报准确度具有极为重要的意义。