[发明专利]一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法

权利要求书

1.一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，其特征在于，该方法的技术流程如下：

1）黄芪外植体的消毒：选取黄芪幼嫩的茎段作为外植体，用自来水冲洗10~20min，在无菌条件下先用75%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞消毒3min，最后用无菌水冲洗4~5次，滤纸吸干水分，获得无菌的黄芪外植体；

2）愈伤组织的诱导与增殖：将黄芪外植体切成0.5~0.7cm长的小段接种于含诱导培养基的培养皿上，置于25±1℃、黑暗条件下培养诱导出愈伤组织，选择生长良好的愈伤组织接种于含增殖培养基的三角瓶中，在相同条件下进行继代增殖培养，每21d继代1次；

3）黄芪细胞的悬浮与分散：继代2~3次后挑选出生长旺盛、质地较为疏松的愈伤组织，接入含100mL悬浮培养基的500mL三角瓶中摇床振荡培养，培养条件为25±1℃、黑暗、转速100~120r/min，每14d 继代1次，继代3~4次逐渐形成稳定的黄芪细胞悬浮培养系，采用酶解法对黄芪细胞进行分散，然后将细胞悬浮液依次用0.9mm和0.1mm的筛网进行过滤，取滤液进行固定化操作；

4）黄芪细胞的固定化：配制浓度为40g/L的无菌海藻酸钠溶液，并添加0.1%（W/V）的鼠李糖脂和2%（W/V）的Fe₃O₄，将步骤3）的滤液与此海藻酸钠溶液混合均匀，用注射器将混合液逐滴滴入浓度为20g/L的无菌CaCl₂溶液中，在磁力搅拌器的搅拌下形成直径约为3mm的固定化凝胶珠，静置30min后放入冰箱过夜，取出用生理盐水洗涤2~3次；

5）固定化细胞的磁场处理：将固定化凝胶珠置于无菌三角瓶中，放入磁场强度为500Gs的低强磁场中处理30min；

6）固定化细胞的培养：使用气升式生物反应器进行培养，在无菌条件下，将磁化后的固定化凝胶珠以10%的接种量接入生产培养基中，装液量为50~60%，通气量为0.10~0.15VVM，温度为25±1℃，在培养的第8d接入5%的芽孢杆菌混悬液，100μmol/L的硫氢化钠，继续培养6-8d后放出培养液，用于黄芪活性成分（黄芪多糖和黄芪皂苷）的分离纯化。

2.根据权利要求1所述的一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，其特征在于，所述步骤2）中诱导培养基的成分为MS基本培养基+1.0g/L水解乳蛋白+0.5mg/L D-泛酸钙+1.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.1mg/L氯化胆碱+30g/L蔗糖+5g/L结冷胶，pH5.6~6.0。

3.根据权利要求1所述的一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，其特征在于，所述步骤2）中增殖培养基的成分为MS基本培养基+2.0g/L水解乳蛋白+0.5mg/L D-泛酸钙+0.6mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+1.0mg/L KT-30+30g/L蔗糖+5g/L结冷胶，pH5.6~6.0。

4.根据权利要求1所述的一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，其特征在于，所述步骤3）中愈伤组织的接种量为40-50g/L。

5.根据权利要求1所述的一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，其特征在于，所述步骤3）中悬浮培养基成分为：MS基本培养基+2.0~3.0g/L水解乳蛋白+0.3~0.5mg/L D-泛酸钙+1.4~1.8mg/L亚精胺+0.5~0.7mg/L 6-BA+0.1~0.3mg/L NAA+0.8~1.2mg/L KT-30+30~40g/L蔗糖，pH5.6~6.0。

6.根据权利要求1所述的一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，其特征在于，所述步骤3）中酶解法的具体操作为：配制浓度为1.0g/L的果胶酶液（酶活40U/mg），向黄芪细胞悬浮液中加入20%体积的该果胶酶液，在28℃、转速60r/min的摇床上酶解24h。

7.根据权利要求1所述的一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，其特征在于，所述步骤4）中滤液与海藻酸钠溶液的体积比为1：4。