[发明专利]一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法

说明书

本发明提供了一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，该方法是通过黄芪外植体的消毒、愈伤组织的诱导与增殖、黄芪细胞的悬浮与分散、黄芪细胞的固定化、固定化细胞的磁场处理以及固定化细胞的培养这一技术流程实现的。本发明在黄芪细胞悬浮培养的基础上采用包埋材料对其进行固定化，再利用生物反应器在特定条件下培养经过磁化的固定化细胞以获得含有黄芪活性成分的培养液，培养液中黄芪多糖的含量高达68.7mg/g，黄芪皂苷的含量高达42.9mg/g，显著高于常规的黄芪细胞悬浮培养，并且固定化细胞还可以重复利用。本发明为黄芪活性成分的获得提供了新途径，也为黄芪活性成分的大规模工业化生产提供理论与技术基础。

技术领域

本发明涉及药用植物细胞工程领域，更具体地说，本发明涉及一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分—黄芪多糖和黄芪皂苷的方法。

背景技术

黄芪又名绵芪、北芪、元芪或黄耆，是豆科黄芪属多年生草本植物，在我国分布较广，主要生长于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江、吉林、辽宁、陕西、河北、山东、宁夏等地，此外青海、四川、新疆等地区以及朝鲜、蒙古、俄罗斯亦有分布。按照《中华人民共和国药典》收录，中药黄芪为膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根，为我国传统滋补中药材，至今已有400多年的药用历史，目前仍为中医临床 治疗最常用的药物之一。黄芪早在《神农本草经》中就有记载有补益强壮之功效。传统中医学认为，黄芪具有补气固表、利尿排毒、敛疮生肌、补中益气的作用。随着科学技术的飞速发展，采用现代科学技术手段研究传统中药已成为时代特色，经过研究证实，黄芪含有多种活性成分，其中最主要的有多糖类、皂苷类、黄酮类化合物，还含有多种氨基酸、微量元素和其它化合物。这些活性成分使得黄芪具有以下药理作用：1、增强机体免疫功能，参与机体免疫调节，促进免疫因子的生成；2、降血压、降血糖，治疗心血管疾病；3、抗肿瘤、抗病毒；4、清除体内自由基，抗氧化、抗衰老；5、利尿、解毒。

随着人们保健意识的增强，具有保健功效的中药以及各种衍生的保健品日益畅销，因此黄芪的需求量也持续增加。但是由于长期大量采挖，近几年来野生黄芪的数量急剧减少，有趋于绝灭的危险，因此野生黄芪已经被列为国家三级保护植物。如今黄芪中药材的来源主要是人工种植，但是人工种植还存在很多问题，如黄芪生长较为缓慢，一般从播种到采收至少需经过3年；人工种植过程中易受季节变换和病虫害的影响；种植的黄芪存在农药和重金属残留的问题；种植的黄芪中活性成分含量较野生黄芪低等。研究表明，药用植物的活性成分主要是其次生代谢产物，通过利用药用植物细胞培养来生产次生代谢产物是克服野生资源短缺、解决人工种植诸多问题的有效途径之一，也是对药材生产的根本性改革。

目前，国内外关于药用植物细胞培养的研究报道有很多，但是实际应用于生产的只占一小部分，分析原因，主要存在以下问题：次生代谢产物的产量过低，放大培养困难，植物细胞的生长速度过慢以及在培养过程中不稳定等。许多研究表明,通过调节微环境等手段可以增加植物次生代谢产物的产量。此外，利用诱导子进行有目的次生代谢产物调控也被广泛应用于植物细胞培养中。诱导子是指能够诱导植物产生防御反应的因子的统称，植物在受到诱导子的刺激时，自身会产生一系列的防御反应,如过敏反应、与植物致病有关蛋白的表达及各类抗性化合物的合成和积累等，因此诱导子可以用于提高植物次生代谢产物的含量。生物反应器培养是实现植物细胞放大培养的一种方式，其具有工作体积大，生产成本低，单位体积生产能力高，且不受时间和地点限制，可进行周年生产等优点，能为药用植物细胞培养和次生代谢产物的生产提供优化的理化环境，因此具有广阔的市场前景。

固定化植物细胞技术是运用化学或物理方法将游离的植物细胞限定在某一特定空间内，使其能够保持活性，进行正常生长代谢的技术。与植物细胞悬浮培养相比，固定化培养具有很多优点，如提高抗剪切能力、保持细胞活力、促进次级代谢产物的合成与分泌、可重复使用并能提高生产效率、易于生产后处理等。如今，国内外研究者已建立了包括银杏、长春花、红豆杉等药用植物在内的50余种植物细胞的固定化培养系统，但是还未见有关黄芪细胞固定化培养的报道。为此，本发明以生产黄芪活性成分为目标，探索了黄芪细胞的固定化方法，并将固定化的黄芪细胞用于小规模的生产，获得了成功。

发明内容