[发明专利]一种基于sp2/0细胞永生化改良的杂交瘤技术

说明书

一种用于生物领域的基于sp2/0细胞永生化改良的杂交瘤技术，其特征在于，将具有永生化特性的hTERT通过pcDNA3.1‑hTERT重组逆转录病毒载体转染鼠sp2/0瘤细胞，获得永生化特性改良的重组载体包装鼠sp2/0瘤细胞，进而经细胞筛选和融合将hTERT导入杂交瘤细胞，从而增强杂交瘤细胞的永生化特性，提高了细胞融合的成功率和融合率，增加了克隆筛选过程的细胞成活率，降低了阳性克隆细胞传代培养中的细胞死亡率，提高了细胞贴壁生长的汇合度，为产业化扩增融合细胞、进而扩增融合细胞内的致病基因奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物领域的一种基于sp2/0细胞永生化改良的杂交瘤技术，主要用于科研、制药和诊断领域的细胞杂交及全基因组的扩增和贮存。

背景技术

杂交瘤技术即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。

克勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)(1975)证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞杂交，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体--单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞杂交，则杂交细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，杂交的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。

建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。杂交细胞的另一方则是为了保持细胞杂交后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加杂交的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞杂交伴侣。

杂交瘤技术是在细胞融合的基础上发展起来的，所以杂交瘤技术也称为细胞融合技术，细胞融合是一个随机的物理学过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经杂交后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中仅存活5～7d，无需特别筛选;细胞的多聚体形式也容易死去;而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。

鉴于细胞DNA合成的两条途径，其中的主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌吟磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细胞融合的选择培养基中有3种关键成分:次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字头称为HAT培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。所以可用HAT培养基选择脾细胞和瘤细胞的有效融合，去除脾细胞和脾细胞、瘤细胞和瘤细胞的无效融合以及未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞、细胞的多聚体等形式的无效融合。

上述的杂交瘤技术或细胞融合技术，是将经过抗原免疫的鼠B细胞与鼠B细胞系恶性肿瘤即多发性骨髓瘤细胞（sp2/0）进行杂交，这种同一体系的细胞可增加杂交的成功率。但如果将其转用于人基因突变淋巴细胞与鼠sp2/0瘤细胞杂交的杂交瘤细胞的制备，我们发现虽能杂交但存在以下3个问题：（1）人基因突变杂交瘤细胞边贴壁生长边漂浮死亡：总有1/2～1/3左右的细胞因死亡而漂浮在培养液中，活细胞贴壁生长的汇合度一般为30～50%，通常不会达到80～90%以上的理想汇合度；（2）罕见病杂交瘤细胞边贴壁生长边贴壁死亡：通常会有1/2～1/3左右的细胞贴壁死亡，不会达到80～90%以上的活细胞贴壁生长的理想汇合度。