[发明专利]能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒

说明书

本发明涉及检验检疫领域，旨在提供一种能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒。该试剂盒中包括：预扩增引物混合液，含有序列如SEQ ID NO：1～14所示预扩增引物；探针混合液，含有序列如SEQ ID NO：15～28所示的左侧探针和右侧探针；MLPA缓冲液；连接缓冲液A；连接缓冲液B；连接酶Ligase‑65；PCR反应混合液，含有序列SEQ ID NO：29和30所示的通用引物；SALSA聚合酶；阴性对照；阳性对照。本发明所述试剂盒具有高通量特点，能同时检测7种病原，利用全自动核酸分析仪，每次可同时检测96个样品，为病原体的鉴别诊断和应急诊断提供高通量检测技术。另外，还具备特异性好和灵敏度高的优点，通过增加RT‑PCR步骤对目标基因进行富集，最低可检出1拷贝的目标基因。

技术领域

本发明提供了一种用于检测禽流感病毒H9、禽流感病毒H5、禽流感病毒H7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒的多重连接探针扩增鉴别检测试剂盒及引物和探针，可实现同时检测7种引起禽呼吸道疾病病原，属于检验检疫领域。

背景技术

禽流感病毒H9、禽流感病毒H5、禽流感病毒H7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒是引起禽呼吸道疾病的常见病原。

由于引起禽呼吸道症状的疾病不止一种，临床表现较为相似，且常见不同病原混合感染，使得通过临床症状和病理变化很难对致病原因进行确诊。目前尚没有一种方法可以一次性对引起禽呼吸道症状的多种疾病进行鉴别。因此建立一种能精准、快速、高效区分不同病原的检测方法，对于鉴别诊断禽呼吸道病原至关重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒。

为解决技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒，该试剂盒中包括：

(1)预扩增引物混合液；

该混合液中包括预扩增引物，其序列如SEQ ID NO：1～14所示；

(2)探针混合液；

该混合液中包括左侧探针和右侧探针，其序列如SEQ ID NO：15～28所示；

(3)MLPA缓冲液；

(4)连接缓冲液A；

(5)连接缓冲液B；

(6)连接酶Ligase-65；

(7)PCR反应混合液，其包括如序列SEQ ID NO：29和30所示的通用引物；

(8)SALSA聚合酶；

(9)阴性对照；

(10)阳性对照。

本发明中，在所述预扩增引物混合液的预扩增引物中：序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2分别是禽流感病毒H9预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：3和序列SEQID NO：4分别是禽流感病毒H5预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：5和序列SEQ IDNO：6分别是禽流感病毒H7预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别是新城疫病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别是禽偏肺病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12分别是禽传染性支气管炎病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14分别是禽传染性喉气管炎病毒预扩增的正向和反向引物；