[发明专利]T细胞特异接头蛋白SLP-76类泛素化的方法及相应的体外高效鉴定

说明书

本发明公开了一种T细胞特异接头蛋白SLP‑76类泛素化的方法，包括以下步骤：构建SLP‑76‑UBC9融合表达质粒；提供SLP‑76羧基端改造质粒；将改造质粒与SUMO1表达质粒在HEK 293T细胞内共表达。本发明还同时提供了一种T细胞特异接头蛋白SLP‑76类泛素化的检测方法，包括以下步骤：取待测细胞加入裂解缓冲液；于冰上放置后离心；用蛋白聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，转膜，孵育SUMO1特异性地抗体和标签蛋白/SLP‑76蛋白抗体；匹配蛋白条带位置，判定SLP‑76是否发生了类泛素化修饰。本发明确保SLP‑76类泛素化修饰鉴定的特异性、高效性和正确性，可重复性好。

技术领域

本发明涉及分子免疫学领域，具体涉及一种体外高效鉴定T细胞特异接头蛋白SLP-76 类泛素化的方法。

背景技术

T细胞是传染性和免疫性疾病研究的核心，在宿主抗胞内病原体感染免疫和内源性病变如肿瘤免疫，以及调度不同的免疫细胞功能中发挥着极其重要的作用。

SLP-76是T细胞特异的免疫接头蛋白(immune adaptors)，本身无酶活性，但在结构上常包含多种结构域功能区(domain)，通过这些功能区介导SLP-76和其它蛋白信号分子相互作用，实现一系列TCR信号传导的调控功能。其一级结构主要功能区包括一个酸性的N末端区、中部的脯氨酸和精氨酸富集区和C末端相对保守的SH2结构域。N末端区包含一个SAM 功能区和三个酪氨酸磷酸化(活化)位点(Tyr-113、Tyr-128和Tyr-145)，能分别结合Nck、 Vav和Itk的SH2区；而SAM功能区能介导SLP-76自身的聚合形成二聚体或多聚体并调控 SLP-76微聚体的形成。SLP-76中部含有脯氨酸富集区和精氨酸富集区，前者与PLCγ1组成性结合，后者与GRB2相关的下游接头蛋白GADs关联。C末端的SH2结构域介导SLP-76 与与下游ADAP的酪氨酸结合，对TCR介导的整合素活化和细胞的黏附有重要作用。SLP-76 是TCR信号传导核心信号轴(TCRp56LckZAP-70LATGADsSLP-76)关键的“节点”枢纽分子,不仅能整合TCR近端(proximal)信号和远端(distal)信号，而且在TCR信号转导中发挥重要的调控作用。SLP-76介导的TCR近端信号事件包括重要信号分子的酪氨酸磷酸化、相互作用和激活；而远端(distal)信号则包括ERK、NF-B等重要信号路径的激活，细胞骨架重排，免疫粘附及细胞因子IL-2分泌增加等。这些TCR信号级联反应最终导致T细胞分化、增殖、活化和效应免疫反应的获得。除此之外，SLP-76对T细胞的发育也有重要作用，SLP-76缺失小鼠胸腺细胞完全被阻滞在双阴性(CD4-CD8-)发育阶段。

泛素化(Ubiquitination)和类泛化(Small ubiquitin-like modifier(SUMO)ylation)是在多种细胞内实现对信号传导精细调控的两种蛋白质翻译后修饰的重要方式，广泛参与调节蛋白质功能和细胞生命活动各个环节。SUMO分子和Ubiquitin都是在结构上很相似的蛋白小分子。并且二者与底物的作用靶点都是赖氨酸(Lysine),目前在真核生物中发现有四种SUMO分子即 SUMO1-4,其介导的蛋白翻译后修饰即类泛素SUMO化。尽管泛素化和SUMO化二者修饰化学反应过程非常类似，而且作用的靶点都是赖氨酸(Lys)，但是它们对被修饰蛋白功能的调控却截然不同。在多数情况下,泛素化和SUMO化以拮抗性的方式调控底物蛋白的功能。不仅如此，在很多细胞中泛素化与类泛素化可作为一对相互制约的调控机制同时存在，并可修饰同一个靶标蛋白甚至竞争性修饰同一个蛋白上的同一个赖氨素残基如IB的K21位点，从而实现对靶标蛋白介导的信号传导路径一正一反的平衡调控。目前，泛素化通路在T细胞信号传导中的调控作用及其机制的研究已十分清楚：主要通过c-Cbl、Cbl-b和Itch等泛素连接酶介导的泛素化修饰导致的降解作用。这些泛素连接酶在T细胞中的靶标分子包括包括Lck、 Fyn、ZAP-70和SLP-76等这些在T细胞激活信号传导中有重要作用的信号分子。这些分子被泛素化修饰后而被降解，从而下调TCR信号传导强度和T细胞免疫反应水平。