[发明专利]石刁柏超低温保存培养方法

权利要求书

1.石刁柏超低温保存培养方法，其特征在于，包括：室温下将培养在预培养液中的长度为1-2mm的石刁柏茎尖置于摇床振荡器中避光黑暗培养1-3d后，用装载液处理20-60min，取出石刁柏茎尖转入温度为0℃的玻璃化溶液中脱水30-50min后放入冻存管中，再将冻存管存于液氮中进行超低温保存。

2.如权利要求1所述的石刁柏超低温保存培养方法，其特征在于，还包括：将冻存管从液氮中取出，吸除玻璃化溶液，用卸载液洗涤石刁柏茎尖1-3次后，转入恢复培养基进行复苏培养。

3.如权利要求2所述的石刁柏超低温保存培养方法，其特征在于，在吸除玻璃化溶剂后，先将石刁柏茎尖置于35-45℃的水浴中浸泡1-5min，再用卸载液洗涤石刁柏茎尖1-3次后，又用无菌水清洗石刁柏茎尖的表面，最后转入恢复培养基进行复苏培养。

4.如权利要求1所述的石刁柏超低温保存培养方法，其特征在于，预培养液为MS培养液，其包括质量分数为5％的DMSO、1.0mg/mL的6-BA、0.5mg/mL的NAA。

5.如权利要求1所述的石刁柏超低温保存培养方法，其特征在于，装载液包括以下成分：MS、2mol/L的丙三醇、0.4mol/L的蔗糖。

6.如权利要求1所述的石刁柏超低温保存培养方法，其特征在于，玻璃化溶液包括：MS、质量分数为30％的丙三醇、质量分数为15％的DMSO、质量分数为15％的乙二醇、0.4mol/L的蔗糖。

7.如权利要求2或3所述的石刁柏超低温保存培养方法，其特征在于，恢复培养基包括：1/2MS、1.0mg/L的6-BA、0.5mg/mL的NAA，卸载液包括：MS、1.0mol/L的蔗糖。

8.如权利要求2或3所述的石刁柏超低温保存培养方法，其特征在于，复苏培养时先在黑暗条件下培养3d，然后转入光照培养7d，光照时间为12h/d，光照强度为1800lux，温度为25℃，湿度为40％。

9.如权利要求1所述的石刁柏超低温保存培养方法，其特征在于，脱水时在脱水装置中进行，所述脱水装置包括用于容纳0℃的玻璃化溶液的第一容器和用于容纳石刁柏茎尖的第二容器，其中，

所述第一容器为顶部敞开的长方体形壳体，所述第一容器水平放置，所述第一容器的内部卡设凹面朝上的弧形隔板，所述弧形隔板的两条线性边分别与所述第一容器顶部的宽边密封以将所述第一容器分隔为位于上方的弧形槽和位于下方的密闭空腔，所述密闭空腔内填充超细玻璃棉；所述第二容器包括支架、转轴、连接杆、容纳壳，所述支架位于所述第一容器外侧，所述转轴可转动的水平设置在所述支架上，所述转轴通过电机驱动，所述连接杆的一端固接在所述转轴上、另一端与所述容纳壳的顶部固接，所述容纳壳为底部具有进样口的球体结构，所述容纳壳上间隔设有四个进液孔，其中两个进液孔靠近所述容纳壳的顶部并关于所述转轴对称，剩余两个进液孔靠近所述进样口并关于所述转轴对称，所述容纳壳的内壁上贴附海绵，所述海绵不遮挡四个进液孔，所述容纳壳不与所述弧形隔板接触，所述进样口可拆卸地设有盖体，所述盖体上固设固定柱，所述固定柱的顶端固设顶部敞开的载物筒，所述固定柱和所述载物筒均位于所述容纳壳内，所述载物筒的顶部顶抵所述容纳壳内的海绵，所述载物筒的侧壁上间隔设有多个通孔，任意一个通孔的轴线均与任意一个进液孔的轴线垂直；当所述容纳壳位于所述弧形槽的正中央时，所述连接杆、所述载物筒、所述固定柱在竖直方向同轴设置；

其中，所述弧形槽内盛装0℃的玻璃化溶液，所述载物筒内容纳石刁柏茎尖，所述弧形槽内盛装的0℃的玻璃化溶液浸没所述容纳壳，当0℃的玻璃化溶液通过四个进液孔、多个通孔充满所述载物筒后，所述电机控制所述转轴先顺时针转动四分之一圈，再逆时针转动四分之一圈，以使所述容纳壳在弧形槽内摆动直到脱水结束，且所述容纳壳始终浸没在玻璃化溶液中。

10.如权利要求1所述的石刁柏超低温保存培养方法，其特征在于，石刁柏茎尖在放入预培养液之前进行了预处理，预处理包括：将石刁柏茎尖置于培养皿中，逐次滴加预处理液，每隔2min滴加0.2mL，共滴加5次，之后将石刁柏茎尖置于蒸馏水中浸没10s，再移入预培养液中，其中，预处理液包括：25mmol/L的肌醇，1.5mol/L的甘氨酸，30mol/L的椰乳，0.3mg/L的玉米素，肌醇、甘氨酸、椰乳、玉米素的体积比为2:3:2:1。