[发明专利]石刁柏超低温保存培养方法

说明书

本发明公开了一种石刁柏超低温保存培养方法，包括：室温下将培养在预培养液中的长度为1‑2mm的石刁柏茎尖置于摇床振荡器中避光黑暗培养1‑5 3后，用装载液处理20‑60min，取出石刁柏茎尖转入温度为0℃的玻璃化溶液中脱水30‑50min后放入冻存管中，再将冻存管存于液氮中进行超低温保存。通过本发明的方法，石刁柏复苏率和再生率均很高，为濒危的石刁柏种质资源保存提供了技术保证，将对百合科天门冬属植物资源的保存以及利用植物多样性来培育新品种提供一条有效途径。

技术领域

本发明涉及种质资源保存技术领域，具体是一种石刁柏超低温保存培养方法。

背景技术

石刁柏(Asparagus officinalis)为百合科天门冬属多年生草本植物，又名芦笋、龙须菜等，其味微甘，性平，具有清热利湿、活血散结等功效。据文献报道，石刁柏中含有丰富的矿物质、氨基酸、芦笋皂苷、多糖和黄酮等类生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗真菌和降血脂的药理活性。石刁柏能清热利湿，活血散结，主治肝炎、银屑病、高脂血症、乳腺增生,另对淋巴肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、皮肤癌等有一定疗效。

超低温保存(Cryopreservation)是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。玻璃化法(Vitrification)超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。石刁柏超低温保存技术在国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种石刁柏超低温保存培养方法，石刁柏复苏率和再生率均很高，为濒危的石刁柏种质资源保存提供了技术保证，将对百合科天门冬属植物资源的保存以及利用植物多样性来培育新品种提供一条有效途径。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种石刁柏超低温保存培养方法，包括：室温下将培养在预培养液中的长度为1-2mm的石刁柏茎尖置于摇床振荡器中避光黑暗培养1-3d后，用装载液处理20-60min，取出石刁柏茎尖转入温度为0℃的玻璃化溶液中脱水30-50min后放入冻存管中，再将冻存管存于液氮中进行超低温保存。

优选的是，还包括：将冻存管从液氮中取出，吸除玻璃化溶液，用卸载液洗涤石刁柏茎尖1-3次后，转入恢复培养基进行复苏培养。

优选的是，在吸除玻璃化溶剂后，先将石刁柏茎尖置于35-45℃的水浴中浸泡1-5min，再用卸载液洗涤石刁柏茎尖1-3次后，又用无菌水清洗石刁柏茎尖的表面，最后转入恢复培养基进行复苏培养。

优选的是，预培养液为MS培养液，其包括质量分数为5％的DMSO、1.0mg/mL的 6-BA、0.5mg/mL的NAA。

优选的是，装载液包括以下成分：MS、2mol/L的丙三醇、0.4mol/L的蔗糖。

优选的是，玻璃化溶液包括：MS、质量分数为30％的丙三醇、质量分数为15％的DMSO、质量分数为15％的乙二醇、0.4mol/L的蔗糖。

优选的是，恢复培养基包括：1/2MS、1.0mg/L的6-BA、0.5mg/mL的NAA，卸载液包括：MS、1.0mol/L的蔗糖。

优选的是，复苏培养时先在黑暗条件下培养3d，然后转入光照培养7d，光照时间为12h/d，光照强度为1800lux，温度为25℃，湿度为40％。

优选的是，脱水时在脱水装置中进行，所述脱水装置包括用于容纳0℃的玻璃化溶液的第一容器和用于容纳石刁柏茎尖的第二容器，其中，