[发明专利]鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统

权利要求书

1.一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法，其特征在于，所述鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法包括：

步骤一，利用生物信息学方法对靶基因的启动子序列进行分析，确定启动子序列；

步骤二，针对目的基因的启动子特异性设计4条特异性引物，用于扩增得到上下游同源臂；

步骤三，以Zymomonas mobilis ZM4 gDNA为模板，分别以引物1+引物2、引物3+引物4扩增得到上下游同源臂；

步骤四，用含有筛选诱导功能区的质粒作为模板，扩增得到筛选诱导功能区片段；

步骤五，以pUC57质粒为模板，PCR扩增得到质粒骨架；

步骤六，将上下游同源臂和筛选诱导功能区通过overlap PCR连接成目的长片段，再通过Gibson装配将长片段与pUC57质粒骨架相连；

步骤七，转化后PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒；

步骤八，用提取的质粒对野生型Z.mobilis 8b进行电转化；

步骤九，待平板上长出单菌落后可进行一次划线传代培养，之后挑取单克隆进行PCR验证；将条带正确的菌株测序确认，确定序列无误后，制备感受态，用于后续实验；

步骤十，将过表达目的sRNA的质粒通过上述电转化的方法转入上一步得到的opmCherry融合表达突变菌株，验证正确后即可得到体内含有目的sRNA-coding region作用对的实验菌株；

步骤十一，对得到的实验菌株采用流式细胞术进行荧光强度的测定，通过与对照组之间进行比较分析，确定作用对之间是否有相互作用。

2.如权利要求1所述的鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法，其特征在于，所述步骤二以Z.mobilis基因组为模板，用引物对ZMO1437US-F/R对US进行PCR扩增，用引物对ZMO1437DS-F/R对DS进行PCR扩增；引物序列为：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

3.如权利要求1所述的鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法，其特征在于，所述步骤三以含有筛选诱导功能区的质粒为模板，用引物Psp-SP Fp、mCherry(+linker)-R进行PCR扩增得到筛选诱导功能区片段，引物序列为：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9。

4.如权利要求1所述的鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法，其特征在于，所述步骤四的引物序列为：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11。

5.如权利要求1所述的鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法，其特征在于，所述步骤五反应体系及PCR程序为：

20μL反应体系：

1437US、筛选诱导功能区片段、1437DS按摩尔比1:1:1加入到反应体系中，10μL2xprimeSTAR Max，补H₂O至终体积20μL；

PCR程序：

第一步：98℃，3min，{98℃(10s)，44℃(10s)，72℃(10s)，10个循环}；

第二步：直接向第一步的产物中加入引物ZMO1437US-F和ZMO1437DS-R各0.8μL(引物浓度为10mM)，再按以下条件进行反应：98℃，3min，{98℃(10s)，55℃(10s)，72℃(10s)，25个循环},72℃(2min)；

获得长片段和pUC57骨架后，通过Gibson装配的方法转化大肠杆菌DH5α，PCR验证平板上的阳性克隆，将验证正确的菌株过夜培养后提取其中的质粒。